Khả năng sinh acidlactic của các chủng VK lactic phân lập tư mắm tôm chua.

24 giờ nuôi cấy

4.3.2. Khả năng sinh acidlactic của các chủng VK lactic phân lập tư mắm tôm chua.

chua.

Khả năng sinh acid lactic làm acid hóa mơi trường là một trong hai đặc tính quan trọng nhất của VK lactic được chúng tơi quan tâm và tìm hiểu ở mức định tính và định lượng như sau:

 Tìm hiểu định tính khả năng sinh acid lactic của VK lactic phân lập từ mắm tôm chua (được tiến hành ở thí nghiệm 3.2.1).

 Tìm hiểu định lượng lượng acid lactic được sinh ra từ VK lactic phân lập từ mắm tôm chua (được tiến hành ở thí nghiệm 3.2.2).

4.3.2.1. Thí nghiệm 3.2.1. Xác định định tính kha năng sinh acid lactic của VK lactic phân lập từ mắm tôm chua

Để tiến hành xác định định tính khả năng sinh acid lactic của 2 chủng NB1 và

NB5, chúng tôi tiến hành thí nghiệm này theo 2 cách:

- Cách I: Sử dụng phương pháp cấy chấm khuẩn lạc của 2 chủng NB1 và NB5 trên môi trường thạch MRS có bở sung CaCO3 0.05 %..

- Cách II: Sử dụng phương pháp khuếch tán trên lỡ thạch trên mơi trường có cơ chất CaCO3.

Phân tích về mơi trường phục vụ thí nghiệm này, chúng tôi đã tiến hành bổ sung thêm thành phần calcium carbonate với hàm lượng 0.05 % (khối lượng) đối với cả 2 môi trường. Sở dĩ bở sung thêm CaCO3 vào mơi trường vì trong q trình ni cấy VK lactic có sự tạo thành acid lactic, CaCO3 sẽ tương tác với lượng acid sinh ra theo phản ứng axit – bazơ. Như vậy, lượng acid lactic sinh ra bao nhiêu sẽ làm tăng bán kính của vòng trịn hoạt tính (có màu trong) của VK bấy nhiêu. Quan trọng ở đây là hàm lượng CaCO3 được bổ sung vào môi trường với hàm lượng rất nhỏ – 0.05 %. Acid lactic là một acid yếu, với hàm lượng quá lớn CaCO3 trong mơi trường, vịng trịn hoạt tính của VK lactic được biểu hiện khơng rõ ràng, khó xác định chính xác và so sánh hoạt tính sinh acid của VK.

Theo cách thứ nhất, chúng tôi sử dụng phương pháp cấy điểm 2 chủng NB1 và NB5 đã được hoạt hóa, mơi trường sử dụng như đã đề cập ở trên là mơi trường MRS có bở sung CaCO3 (pH 6.5 ± 0.2; nuôi ở nhiệt độ 30 oC ± 2.0 oC). Tiến hành quan sát và theo dõi sự thay đổi trên đĩa thạch. Kết quả được chúng tôi ghi nhận ở bảng sau:

Bảng 4.6: Kêt quả theo dõi sự hình thành vòng tròn hoạt tính sinh acid lactic của 2 chủng NB1 và NB5

Chủng

Đặc điểm NB1 NB5

Đặc điểm chung

VK phát triển tạo thành khuẩn lạc.

- Xung quanh khuẩn lạc xuất hiện vịng trịn màu trong lan ra mơi trường.

- Theo thời gian nuôi cấy (trong khoảng 24 – 48 giờ), khuẩn lạc tiếp tục phát triển, vòng tròn tiếp tục lan rộng ra môi trường làm trong phần môi trường bên trong nó.

Đặc điểm sai khác

- Màu sắc của khuẩn lạc

- Kích thước của bán kính vòng tròn hoạt tính sinh acid thay đổi theo thời gian

- Khuẩn lạc của chủng NB1 có màu trắng phớt vàng.

- Vịng trịn được tạo ra xung quanh khuẩn lạc có bán kính (D – d, mm) trung bình khoảng 3.5 – 3.6 (mm).

- Theo thời gian ni cấy, (trong vịng 24 – 72 giờ), bên cạnh việc khuẩn lạc tiếp tục phát triển, vòng tròn tiếp tục lan rộng ra môi trường, đạt bán kính (D – d, mm) trung bình khoảng 3.5 – 4.0 (mm)

- Khuẩn lạc của chủng NB5 có màu trắng đục.

- Vòng tròn được tạo ra xung quanh khuẩn lạc có bán kính (D – d, mm) trung bình khoảng 5.5 – 5.7 (mm).

- Theo thời gian ni cấy, (trong vịng 24 – 72 giờ), bên cạnh việc khuẩn lạc tiếp tục phát triển, vòng tròn tiếp tục lan rộng ra môi trường, đạt bán kính (D – d, mm) trung bình khoảng 5.5 – 6.0 (mm)

Hình 4.5: Vòng tròn hoạt tính sinh acid lactic hình thành xung quanh khuẩn lạc chủng NB1

Hình 4.6: Vòng tròn hoạt tính sinh acid lactic hình thành xung quanh khuẩn lạc chủng NB5

Như vậy, ta nhận thấy các chủng VK lactic khác nhau (mà ở đây là 2 chủng VK thuộc 2 loài Streptococcus – NB1 và loài Lactobacillus – NB5) có khả năng sinh acid lactic khác nhau. Dựa vào kích thước vòng tròn hoạt tính của 2 chủng, bước đầu chúng tơi nhận thấy chủng NB5 có khả năng sinh acid lactic lớn hơn chủng NB1 (xét ở cùng thời điểm nuôi cấy), cần tiếp tục tiến hành thí nghiệm khác để làm sáng tỏ luận điểm này. Mặt khác, do vòng trịn hoạt tính biến thiên theo thời gian ni cấy, vì thế mà xét về mặt thời gian, lượng acid lactic sinh ra ở các thời điểm khác nhau là khác nhau (xét trong cùng 1 chủng, thời gian nuôi cấy từ 24 – 72 giờ).

Với những kết quả thu được từ cách I, chúng tơi tiếp tục tìm các luận cứ để đánh giá định tính khả năng sinh acid lactic của 2 chủng NB1 và NB5 bằng cách thay thế toàn bộ thành phần môi trường MRS bằng cơ chất CaCO3 (vẫn với tỷ lệ 0.05 % khối lượng) và agar (hàm lượng 20 g/l) vẫn giữ nguyên. Với môi trường thạch bổ sung CaCO3, chúng tôi sử dụng phương pháp khuếch tán trên lỡ thạch. Đờng thời, trong q trình thực hiện, chúng tôi tiến hành đo pH của dịch nuôi cấy tại các thời điểm 24, 48, 72, 96 giờ nuôi cấy; mục đích nhằm xác định sự biến thiên của pH môi trường. Kết quả chúng tôi thu được như sau:

Bảng 4.7: Mức độ acid hóa môi trường của 2 chủng NB1 và NB5 Giờ

Chủng

24 giờ 48 giờ 72 giờ 96 giờ

D – dTB(mm) (mm) pHTB D – dTB (mm) pHTB D – dTB (mm) pHTB D – dTB (mm) pHTB NB1 3.2 4.49 3.9 4.12 4.4 3.64 5.1 4.30 NB5 2.9 4.51 4.3 4.04 5.1 3.45 4.6 4.09

Chú thích: D – d TB Bán kính vịng trịn hoạt tính được đo trung bình Theo sự biến thiên pH của dịch nuôi cấy theo thời gian, ta thấy rằng pH của dịch nuôi cấy giảm dần theo thời gian từ 24 giờ – 72 giờ nuôi cấy, sau đó có xu hướng tăng lên sau 72 giờ ni cấy, đạt pH cực đại ở thời điểm 72 giờ ni cấy. Mặt khác, ta thấy chủng NB5 có khả năng làm thay đổi pH môi trường cao hơn chủng NB1 chứng tỏ

chủng NB5 có khả năng sinh acid lactic mạnh hơn chủng NB1. Ta cần tiếp tục đối chiếu với kết quả của các thí nghiệm sau để hoàn thiện kết luận này.

Mặt khác, dựa vào sự thay đởi bán kính vịng trịn hoạt tính sinh acid (D – d, mm), ta thấy được những suy luận ở cách I là chính xác (xét một cách định tính và cảm quan). Điều đó có nghĩa là, xét trong cùng 1 chủng, điều kiện nuôi cấy như nhau, lượng acid lactic được sinh ra tăng dần theo thời gian trong khoảng 24 – 72 giờ; sau đó, lượng acid lactic có xu hướng giảm dần sau 72 giờ – từ 72 đến 96 giờ. Mặt khác, xét đối với 2 chủng NB1 và NB5, nuôi cấy cùng một điều kiện, chủng NB5 có khả năng sinh acid lactic cao hơn chủng NB1. Các kết luận này chỉ mang tính định tính, vì vậy cần phải tiến hành định lượng để có thể kết luận chính xác về khả năng sinh acid lactic của 2 chủng NB1 và NB5.

Hình 4.7: Vòng tròn hoạt tính sinh acid lactic khuêch tán trên lỗ thạch của chủng NB1

Hình 4.8: Vòng tròn hoạt tính sinh acid lactic khuêch tán trên lỗ thạch của chủng NB5

Tổng kết lại những kết luận của thí nghiệm 3.2.1:

- Đối với từng chủng VK lactic, lượng acid lactic sinh ra ở các thời điểm khác nhau là khác nhau:

o Lượng acid lactic tăng dần theo thời gian từ 24 giờ đến 72 giờ và có xu hướng giảm dần sau 72 giờ.

- Chủng NB5 có khả năng sinh acid lactic cao hơn chủng NB1.

4.3.2.2. Thí nghiệm 3.2.2. Xác định định lượng kha năng sinh acid lactic của các chủng nghiên cứu.

Thí nghiệm này được thực hiện với mục đích định lượng tương đối lượng acid lactic được sinh ra bởi 2 chủng NB1 và NB5, từ đó để khẳng định và thống nhất những luận điểm của thí nghiệm 3.2.1 (đã định tính xác định). Để tiến hành thí nghiệm này, chúng tôi nuôi cấy 2 chủng NB1 và NB5 trên môi trường MRS lỏng, ở 30oC từ 24 – 96 giờ, sau đó xác định lượng acid lactic tạo thành theo phương pháp chuẩn độ Therner (0T). Kết quả sau khi chuẩn độ bằng dung dịch NaOH 0.1 N như sau:

Bảng 4.8: Kêt quả định lượng khả năng sinh acid lactic của 2 chủng NB1 và NB5 Thời gian

Chỉ số

Chủng NB1 Chủng NB5 24

giờ giờ48 giờ72 giờ96 giờ24 giờ48 giờ72 Giờ96 nTB (ml) 19.5 24.6 25.9 25.5 20.8 23.3 25.5 24.6

To

TB(ml) 195 246 259 255 208 233 255 246

A % TB

(g/100ml) 1.75 2.21 2.33 2.29 1.87 2.10 2.30 2.21

Chú thích: n (ml): Lượng NaOH 0.1 N đã dùng để trung hòa 100 ml dung dịch mẫu.

To (ml): Lượng NaOH đã dùng để trung hòa 100 ml dung dịch mẫu. A % (g/100 ml mẫu): Lượng acid lactic trong 100 ml dung dịch mẫu

Dựa vào đường cong sinh trưởng của 2 chủng NB1 và NB5 đã được tìm hiểu ở thí nghiệm 3.1 cũng như quá trình tạo thành acid lactic của 2 chủng này, chúng tôi phân tích một vài điểm như sau:

 Trong điều kiện lên men (ở đây là môi trường MRS dịch thể, pH ban đầu 6.5, to nuôi cấy ổn định 30 oC …), VK lactic sinh trưởng tăng sinh khối theo thời gian. Đờng thời, trong q trình sinh trưởng, sản phẩm của chúng – acid lactic cũng được sinh ra, làm giảm dần dần pH của dịch lên men.

 Khi sinh khối của VK lactic đạt ngưỡng cực đại thì sản phẩm acid lactic vẫn tiếp tục được tạo ra và đạt ngưỡng cực đại muộn hơn. Khi đó, pH của dịch ni cấy mới đạt

giá trị cực đại.

 Sau q trình ởn định và đạt giá trị cực đại, pH của dịch nuôi cấy sẽ tăng nhẹ. Sở dĩ như vậy có thể do:

o Mơi trường hết các chất dinh dưỡng, nguồn cung cấp C cho VK lactic sinh trưởng hết, chúng sử dụng lại chính sản phẩm của mình là acid lactic làm thức ăn. Lượng acid lactic giảm dần trong dịch nuôi cấy làm pH tăng nhẹ.

o Ở điều kiện pH thấp (do acid lactic tạo ra) làm ức chế sự hoạt động của các vi sinh vật khác. Tuy nhiên, ở một giá trị nhất định nào đó thì pH cũng là một yếu tố có tác dụng ức chế ngược, kìm hãm chính sự sinh trưởng của VK lactic (bên cạnh các vi sinh vật khác).

o Sự xâm nhiễm của các vi sinh vật khác vào môi trường làm tăng pH của môi trường. Như vậy, chúng tôi đã khái quát về khả năng sinh acid của VK lactic như sau:  Lượng acid lactic sinh ra ở các thời điểm khác nhau là khác nhau. Lượng acid lactic

tăng dần theo thời gian nuôi cấy từ 24 giờ đến 72 giờ và có xu hướng giảm dần từ 72 giờ trở đi, qua đó cho thấy lượng acid sinh ra đạt cực đại trong khoảng thời gian từ 48 giờ đến 72 giờ.

 Ta thấy động học của quá trình sinh acid lactic ở 2 chủng VK lactic này khá giống với động học của quá trình sinh trưởng của chúng. Vì vậy, cần tìm hiểu và nghiên cứu kỹ hơn.

Tuy nhiên, với kết quả của thí nghiệm định lượng này, chúng tôi chưa thể chứng minh được chính xác chủng NB1 có khả năng sinh acid lactic cao hơn chủng NB5 hay

không. Đề tài này chỉ sơ bộ xác định khả năng sinh acid lactic của 2 chủng, chưa cụ thể so sánh khả năng sinh acid lactic của 2 chủng này với nhau và với đối chứng.

4.3.3. Tìm hiểu khả năng sinh bacterioxin của VK lactic phân lập tư mắm tômchua. chua.

Từ trước đến nay, việc đánh giá khả năng tạo bacterioxin của VK lactic đã được nghiên cứu khá nhiều. Tuy nhiên, mục đích của thí nghiệm này chỉ dừng ở mức xác định định tính khả năng sinh bacterioxin của VK lactic (mà ở đây là 2 chủng NB1 và NB5).

VSV chỉ thị được chúng tôi sử dụng 6 chủng thu thập như sau:  Chủng Bacillus sp.

 Chủng E. Coli

 Chủng Salmonella sp.

 Chủng Staphylococcus “trắng”.  Chủng Staphylococcus “vàng”.

Trong q trình tìm hiểu, chúng tơi thấy rằng, khả năng ức chế khuẩn của VK lactic do chúng có khả năng sinh acid lactic (làm acid hố mơi trường) và khả năng sinh bacterioxin (tuỳ lồi có khả năng sinh bacterioxin). Như vậy, để xác định khả năng sinh bacterioxin, ta cần loại bỏ yếu tố pH acid của môi trường bằng cách trung hồ dịch ni cấy bằng NaOH 0.1 N, kiểm tra bằng giấy thử quỳ tím (giấy hoá màu xanh).

Thí nghiệm 3.3: Xác định kha năng sinh bacterioxin của VK lactic phân lập từ mắm tôm chua.

Sử dụng phương pháp xác định sự có mặt bacterioxin như đã trình bày trên mơi trường thạch LB và môi trường thạch dinh dưỡng – Nutrient Agar, chúng tôi thu được kết quả như sau:

 Tăm thấm dịch nuôi cấy chủng NB1 (đã xử lý yếu tố pH) làm giống nghiên cứu của 6 chủng VSV chỉ thị không mọc được xung quanh.

 Tăm thấm dịch nuôi cấy chủng NB5 (đã xử lý yếu tố pH) khơng có tác dụng với 6 chủng VSV chỉ thị, chúng vẫn phát triển bình thường.

Hình 4.10: Khả năng sinh bacterioxin của chủng NB1 kháng Pseudomonas sp.

Chúng tơi tóm tắt lại khả năng kháng của 2 chủng NB1 và NB5 như sau:

Bảng 4.9: Khả năng sinh bacterioxin của 2 chủng NB1 và NB5 Chủng VSV chỉ thị NB1 NB5 Bacillus sp. (+) (-) Pseudomonas sp. (+) (-) E. Coli (+) (-) Salmonella sp. (+) (-) Staphylococcus “trắng” (+) (-) Staphylococcus “vàng” (+) (-)

Chú thích: (+) Cho kết quả kháng dương tính (-) Cho kết quả kháng âm tính

Chủng Lactobacillus sp. không thể hiện khả năng kháng khuẩn sau khi trung hoà lượng acid lactic sinh ra trong dịch nuôi cấy, chứng tỏ chủng NB5 khơng có khả năng sinh bacterioxin. Bên cạnh đó, chủng Streptococcus sp. vẫn thể hiện khả năng kháng khuẩn ngay cả khi đã trung hoà lượng acid sinh ra trong dịch ni cấy, chứng tỏ chủng NB1 có sinh ra một chất khác có tính kháng khuẩn, có thể là bacterioxin.

Với kết quả này, chúng tôi sơ bộ kết luận rằng, chủng NB1 có thể có khả năng sinh bacterioxin – có hoạt tính kháng khuẩn, trong khi đó, chủng NB5 khơng có khả

năng sinh bacterioxin.

4.3.4. Tìm hiểu ảnh hưởng của yếu tố nhiệt độ đến sự sinh trưởng của các chủngnghiên cứu. nghiên cứu.

Như các tài liệu đã cơng bố và khẳng định, nhiệt độ có ảnh hưởng trực tiếp đến quá trình lên men lactic và chất lượng sản phẩm mắm tôm chua. Thông thường, trong dân gian, người ta thấy rằng mùa nắng, mùa hè, mùa có nhiệt độ cao, lên men mắm tôm chua nhanh chín; mùa mưa, mưa đơng, mùa có nhiệt độ thấp, lên men mắm tơm chua lâu chín hơn. Nhiệt độ càng cao (trong mức giới hạn về nhiệt độ) thì q trình lên men mắm tơm chua càng nhau, lượng axit chung tích lũy trong môi trường (bao gồm cả axit lactic) càng nhiều.

Thí nghiệm 3.4: Tìm hiểu anh hưởng của ́u tớ nhiệt độ đến sự sinh trưởng của VK lactic được phân lập.

Căn cứ vào luận điểm trên, chúng tôi tiến hành thử khả năng sinh trưởng của 2 chủng NB1 và NB5 phân lập từ mắm tôm chua trên môi trường MRS lỏng ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau. Để xác định được giới hạn sinh thái về yếu tố nhiệt độ của 2 chủng NB1 và NB5, chúng tôi nuôi cấy chúng ở các điều kiện nhiệt độ như sau: 15 oC; 20oC; 25oC, 30oC; 35oC, 40oC; 45oC trong 72 giờ, đo OD620 nm ở các thời điểm 24 giờ, 36 giờ, 48 giờ. Kết quả đo OD620 nm được tổng hợp như bảng sau:

Bảng 4.10: Kết quả đo OD620 nm khi nuôi cấy NB1 và NB5 ở các nhiệt độ khác nhau.

OD620 nm TRUNG BÌNH Chủng

to

NB1 NB5