M2
Tần số đột biến và thường biến phóng xạ được tính theo công thức của Vatti K.V và Tikhomirova M.M, 1979 [1],[10].
Sai số phần trăm: m% = + f% . (100 – f%) f: số cá thể mang biến dị trong lô n: tổng số cá thể trong lô nghiên cứu
2.2.5. Phương pháp khảo sát các dòng đột biến chín sớm, đẻ nhánh nhiều ở M3
2.2.5.1. Triển khai thí nghiệm ngoài đồng ruộng (M3)
Chúng tôi tiến hành gieo riêng một số thể đột biến chín sớm, đẻ nhánh nhiều, hạt to, hạt xếp xít và chiều dài bông tăng phát sinh ở M2 sang M3 nhằm nghiên cứu đặc điểm di truyền của các tính trạng có giá trị kinh tế cao. Hạt từ M2 được lấy từ các bông chính, gieo cạnh lô đối chứng, cấy một dảnh một khóm theo công thức 20x15cm, khi mạ được khoảng 15-20 ngày tuổi. Phương pháp bón phân, chăm sóc, phòng trừ sâu bệnh theo quy trình khảo nghiệm giống [2].
2.2.5.2. Phương pháp thu thập và xử lí số liệu
Các chỉ tiêu nông sinh học được xác định theo “Hệ thống tiêu chuẩn đánh giá cây lúa” của IRRI năm 1996 [11]. Một số tiêu chuẩn được cụ thể hóa theo hệ thống đánh giá tiêu chuẩn đối với lúa đang dùng trong khảo nghiệm lúa ở Việt Nam (xem phụ lục-bảng 4).
Đối với các tính trạng số lượng, dùng các công thức: - Trung bình của mẫu:
- Độ lệch chuẩn: δ = + với n > 30 δ = + với n < 30 n X = n ∑ fi . Xi ∑ fi .(Xi - X )2 n ∑ fi .(Xi - X )2 n - 1
- Sai số trung bình: m =
Trong đó: fi: Tần số các biến số cùng loại Xi: Giá trị các biến số
n: Số lượng cá thể trong mẫu
2.2.5.3. Phương pháp phân tích chất lương thóc gạo trong phòng thí nghiệm phòng thí nghiệm
Được thực hiện trong phòng thí nghiệm Sinh lý Thực vật và Sinh hóa thuộc khoa Sinh, Trường ĐHSP. TP. HCM.
Chuẩn bị mẫu: lúa được phơi khô, bóc vỏ, xay nhuyễn, đem sấy 2h ở 800C, sau đó sấy liên tục ở 650C, đem đi cân cho đến khi trọng lượng không đổi (mẫu khô tuyệt đối ).
Phương pháp xác định các chỉ tiêu sinh hóa: - Xác định hàm lượng amylose:
Xác định theo phương pháp của IRRI (Perez và Juliano, 1981) (Lê Doãn Diên, 2002) [4]. Cân chính xác 100mg mẫu cho vào bình tam giác 200ml rồi cho vào đó 6,6 ml NaOH 1N. Lắc đều rồi để qua đêm ở nhiệt độ phòng. Sáng hôm sau dùng đũa thủy tinh khuấy đều, cho nước cất vào cho đến 100 ml. Lấy 10 ml dung dịch ( đã khuấy đều) cho vào bình tam giác dung tích 200ml ( bình có vạch đo mực nước) rồi cho nước cất đến vạch 150 ml, trung hòa bằng HCl 1N cho đến lúc pH =5 thêm vào đó 2 ml dung dịch Lugol lắc đều rồi lấy 25 ml dung dịch thu được pha sao cho tổng thể tích bằng150ml. Lắc đều, cho vào Cuvet đưa lên máy đo quang phổ đo ở bước sóng 700nm ta sẽ được độ hấp phụ tinh bột. Sau đó so với đường chuẩn ta sẽ biết được lượng tinh bột trong mẫu
Công thức: A x a % Amylose = x 100 g δ √n
A: hàm lượng amylose đo trên máy quảng phổ (mg/l) a: nồng độ pha loãng
g: khối lượng mẫu nghiên cứu (mg)
Phân loại gạo dựa trên hàm lượng amylose trong tinh bột (Xem phụ lục– bảng 5)
- Xác định hàm lượng protein:
Các dạng Nitrogen trong gạo được xác định trên cơ sở protein thô (N tổng số, N phi protein) bằng phương pháp Micro-Kjeldahl (Yoshida et al.,1976, Lê Doãn Liên, 2002 [4]. Hàm lượng protein được tính ra bằng cách nhân hàm lượng của Nitrogen tổng số: % protein thô = %Nts x 6.5
- Độ hóa hồ:
(Theo phương pháp của Little và cộng sự (1958)
Độ hoá hồ được xác định bằng dung dịch KOH 1.7% trong 23h ở nhiệt độ là 300C: Dùng đĩa petri xếp 6 hạt gạo trắng vào mỗi hộp, xếp các hạt tách ra để khi tan ra chúng không chạm vào nhau. Cho 10 ml KOH 1.7% vào, đậy nắp hộp và để yên trong 23h.
Đánh giá độ hóa hồ theo tiêu chuẩn hệ thống đánh giá mẫu của IRRI, 1996 ( Xem phụ lục-bảng 6)
- Độ bền thể gel:
(Theo phương pháp của Tang và cộng sự, 1991)
Các mẫu để cùng phòng 2 ngày cho độ ẩm bằng nhau, nghiền mẫu và rây thành bột mịn 100 mesh. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Cân mỗi mẫu 100mg cho vào ống nghiệm 13x100mm (mỗi mẫu lặp lại 3 lần). Cho vào ống nghiệm 0,2 ml ethanol 95% có chứa 0,025% Thymol blue. Thêm 2ml KOH 0,2N. Lắc trên máy Vortex genie ở tốc độ 6 để trộn, bịt ống nghiệm bằng giấy nhôm.
Đun các ống nghiệm trong nồi chưng cách thủy đang sôi trong 8 phút rồi lấy ra để yên 5 phút, sau đó làm lạnh trong nước đá 20 phút.
Đặt các ống nghiệm nằm ngang trên giấy kẻ ô, để gel chảy từ từ. Sau 1 giờ đọc kết quả: đo chiều dài gel từ đáy ống nghiệm đến mí gel.
Phân loại gel theo IRRI, 1996 [7] (Xem phụ lục-bảng 7).
2.3. Địa điểm và thời gian nghiên cứu 2.3.1. Địa điểm nghiên cứu 2.3.1. Địa điểm nghiên cứu
Gây đột biến phóng xạ tại Trung tâm chiếu xạ Quốc gia Từ Liêm – Hà Nội.
Địa điểm gieo trồng và theo dõi tại đồng ruộng xã Hiệp Tân, huyện Hòa Thành, tỉnh Tây Ninh
2.3.2. Thời gian nghiên cứu
Thời gian thực hiện luận văn khoảng 12 tháng từ 11/2010 – 10/201 (vụ xuân và vụ mùa năm 2011).
Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. Ảnh hưởng của liều chiếu xạ nguồn Co60lên tỷ lệ sống sót thời kì mạ, đẻ nhánh và trổ chín trên các giống lúa nghiên cứu
Tỷ lệ sống sót qua các thời kì phản ánh rõ rệt nhất tác động hủy hoại của tia gamma lên mô, tế bào và sức sống của cơ thể. Khi chiếu xạ lên hạt khô, các tác giả đều thống nhất kết luận: liều lượng thấp có tác dụng kích thích hạt nảy mầm và sinh trưởng phát triển. Liều lượng cao thì ức chế sinh trưởng, phát triển và nếu liều lượng cao hơn nữa thì sẽ gây chết tế bào và cơ thể. Đối với hạt ướt, hạt nảy mầm thì độ mẫn cảm đối với chiếu xạ tăng lên rõ rệt so với hạt khô, vì vậy chúng tôi chỉ sử dụng 2 liều xạ là 10 và 15 kR.
Bảng 3.1 Tỷ lệ sống sót qua các thời kì sinh trưởng và phát triển ở thế hệ M2 khi xử lí bằng tia gamma nguồn Co60trên các giống lúa nghiên cứu
Giống Liều lượng Tổng số hạt gieo Tỷ lệ sống sót thời kỳ mạ Tỷ lệ sống sót thời kỳ đẻ nhánh Tỷ lệ sống sót thời kỳ trỗ-chín Số lượng f% + m% Số lượng f% + m% Số lượng f% + m% TD 1 ĐC 1840 1828 99,3 1824 99,1 1820 98,9 10 kR 1890 1865 98,7 1853 98,0 1850 97,9 15 kR 1960 1915 97,7 1898 96,8 1895 96,7 TTĐB ĐC 1870 1862 99,6 1854 99,1 1850 98,9 10 kR 1993 1920 96,3 1905 95,6 1892 94,9 15 kR 1990 1915 96,2 1882 94,6 1870 94,0 TD 2.2 ĐC 1870 1865 99,7 1853 99,1 1852 99,0 10 kR 1995 1935 97,0 1924 96,4 1918 96,1
Số liệu trình bày ở bảng 3.1 cho thấy:
Tỷ lệ sống sót của các giống ở giai đoạn mạ cao hơn giai đoạn đẻ nhánh và cao hơn thời kỳ trổ - chín. Hiện tượng này cho thấy tác dụng hủy hoại của tia gamma không chỉ gây chết ngay các tế bào phôi mầm hạt mà còn gây chết khi
các tế bào phôi mầm phân bào. Đây là hiện tượng gây chết xa của phóng xạ đối với thực vật.
Các lô chiếu xạ đều có tỷ lệ sống sót thấp hơn so với lô đối chứng, mức độ hủy hoại tế bào tăng tuyến tính với liều xạ. Tuy nhiên mức độ giảm so với đối chứng và so giữa 2 lô được chiếu xạ với liều lượng khác nhau thì không giống nhau ở tất cả các giống, điều này phản ánh sự phản ứng khác nhau của các giống (kiểu gen) khác nhau đối với cùng một liều lượng phóng xạ. Ví dụ như cùng liều xạ là 10 kR nhưng ở TD 1 có tỷ lệ sống sót ở thời kì mạ là: 98,7 còn TD 2.2 là: 97,0 và TTĐB là: 96,3. Hình 3.1 Biểu đồ tỷ lệ sống sót thời kì mạ 94 95 96 97 98 99 100 TD1 TTĐB TD 2.2 Giống Tỷ lệ % ĐC 10 kR 15 kR Hình 3.2 Biểu đồ tỷ lệ sống sót thời kì đẻ nhánh 92 93 94 95 96 97 98 99 100 TD1 TTĐB TD 2.2 Giống Tỷ lệ % ĐC 10 kR 15 kR
Hình 3.3 Biểu đồ tỷ lệ sống sót thời kì trổ-chín 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 TD1 TTĐB TD 2.2 Giống Tỷ lệ % ĐC 10 kR 15 kR
3.2. Sự phát sinh một số đột biến hình thái ở M2 do xử lý bằng tia gamma (nguồn Co60) trên các giống lúa nghiên cứu gamma (nguồn Co60) trên các giống lúa nghiên cứu
3.2.1. Đột biến về thân cây3.2.1.1. Đột biến cây thấp 3.2.1.1. Đột biến cây thấp
Chiều cao cây là đặc tính liên quan đến khả năng chống đổ và hệ số kinh tế, với giống cây cao thường dễ đổ và hệ số kinh tế thấp. Ngược lại giống cây thấp, khả năng chống đổ tốt hơn và hệ số kinh tế cao hơn. Sự biến dị chiều cao cây ở M1 có thể do tác động của tác nhân phóng xạ theo kiểu phản ứng thường biến. Nếu được duy trì qua một số thế hệ sau thì có thể xem đây là biến đổi trong gen. Tuy nhiên chiều cao cây có thể còn phụ thuộc vào môi trường như: chân ruộng, mật độ cấy, điều kiện dinh dưỡng,…
Theo “Hệ thống tiêu chuẩn đánh giá cây lúa” IRRI [11], chiều cao cây lúa được chia thành 3 loại chính:
- Nửa lùn (vùng thấp < 110 cm, vùng cao < 90 cm)
- Trung gian (vùng thấp: 110 – 130 cm, vùng cao: 90 – 125 cm) - Cao (vùng thấp > 130 cm, vùng cao >125 cm)
Bảng 3.2. Sự phát sinh đột biến chiều cao cây ở M2 do tác dụng của tia gamma nguồn Co60 Đơn vị tính tần số: % Giống Liều lượng Tổng số cá thể
Cây cao Cây thấp
Số lượng f% + m% Số lượng f% + m% TD 1 ĐC 1820 0 0 0 0 10 kR 1850 4 0,22 + 0,11 5 0,27 + 0,12 15 kR 1895 6 0,32 + 0,13 8 0,42 + 0,14 TTĐB ĐC 1844 0 0 0 0 10 kR 1892 3 0,15 + 0,08 8 0,42 + 0,14 15 kR 1870 5 0,27 + 0,12 13 0,69 + 0,19 TD 2.2 ĐC 1852 0 0 0 0 10 kR 1918 3 0,16 + 0,09 12 0,63 + 0,18 Tính chung 14941 21 0,14 + 0,03 46 0,31 + 0,05
Đột biến cây thấp được nhiều nhà chọn giống quan tâm vì cây thấp có khả năng chống đổ ngã, phản ứng cao với phân bón, dễ đảm bảo cho tỉ lệ tối ưu giữa chiều dài bông và chiều dài thân là 1/3, tạo điều kiện tốt nhất cho cây sử dụng chất dinh dưỡng ở mức độ cao để làm hạt.
Trong nghiên cứu của chúng tôi, giống đối chứng thuộc loại hình thân hơi cao (TTĐB trung bình khoảng 145 cm, TD 1 trung bình khoảng 130 cm và TD 2.2 trung bình từ 120-125cm), khi gặp điều kiện thời tiết bất lợi thường hay đổ. Các dạng lúa đột biến nghiên cứu có độ dài thân thuộc loại hình thân trung gian giữa trung bình và thấp, thấp hơn đối chứng từ 15cm -20cm trở lên, do vậy tính kháng đổ sẽ cao hơn so với giống gốc. Điều này cho thấy trong quá trình xử lí đột biến, từ giống gốc ban đầu đã xuất hiện các biến dị về tính trạng chiều dài thân ở M1, M2. Trong nghiên cứu ở M2, chúng tôi nhận được một số dạng đột biến cây thấp từ 65-100 cm, có lá xanh đậm. đẻ nhiều nhánh, hạt nhỏ hoặc hạt có hình dạng thay đổi, một số khác có lá nhỏ, bông ngắn.
Liều lượng 10 kR cho tần số đột biến cây thấp ở giống lúa TD 2.2 là 0,63 + 0,18 và TTĐB là 0,42 + 0,14 trong khi TD 1 có tần số đột biến là 0,27 + 0,12. Ở liều lượng 15kR, tần số đột biến ở giống TTĐB là 0,69 + 0,19 và TD 1 là 0,42 + 0,14. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Theo Chang T.T. (1964-1983) có 8 alen xác định tính trạng lùn thuộc các nhóm liên kết khác nhau, trong đó alen d4 thuộc nhóm liên kết (I); d2 và d3 thuộc nhóm liên kết (II) ; d6 và d7 thuộc nhóm liên kết (IV); d1 thuộc nhóm liên kết (V); d5 thuộc nhóm liên kết (X) và d8 thuộc nhóm liên kết (XI).
Theo Khush G.S và Toenniesen G.H (1991) có tới hơn 50 gen gây nên tính lùn hoặc rút ngắn một số bộ phận của nó. Hầu hết đều là các gen lặn, chỉ có một gen trội là D53 (Dk3) thuộc NST số 9 (nhóm liên kết VIII). Trừ NST số 7, các gen gây tính lùn nói trên được phân bố trên 11 NST còn lại.
Có nhiều kiểu lùn khác nhau tùy thuộc vào kiểu gen của cây đó. Các tác giả đã xác định được một số kiểu lùn khác nhau do các gen khác nhau quy định: lùn Hosetzu-gen d18; lùn Tanginbozu; lùn Kyushu-gen d53…(Shinbashi-Nobori 1975; Kamizima,Osamura-1984; Dziuba 1974-1976…) [1].
Có thể khi phóng xạ bằng tia gamma (Co60) vào hạt M0 đã gây ra đột biến gen D thành gen d. Hạt M1 có kiểu gen dd, hạt này mọc thành cây lùn ở M2. Đối chiếu các kết quả quan sát và đo đếm thì thấy ở lô đối chứng không xuất hiện dạng biến dị cây thấp, ở lô chiếu xạ đều xuất hiện dạng biến dị này, liều lượng chiếu xạ tăng thì tần số đột biến kiểu cây thấp cũng tăng theo.
Hình 3.4 Đột biến cây thấp ở TD1
Hình 3.5 Biểu đồ tần số đột biến cây thấp ở M2
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 TD 1 TTĐB TD 2.2 Giống TSĐ B f% ĐC 10 kR 15 kR
3.2.1.2. Đột biến cây cao
Ở M2, các kiểu cây cao xuất hiện thường cao hơn dạng gốc từ 10-30cm , tất cả các thể đột biến này đều có chung một số tính trạng: lá nhỏ, màu sắc thân nhạt hơn, hạt nhỏ, trổ bông sớm,… Ở mỗi dòng lúa nghiên cứu khi gieo trồng ở vụ xuân thường có chiều cao cây cao hơn ở vụ mùa, chứng tỏ tính trạng chiều cao cây còn chịu sự ảnh hưởng của điều kiện khí hậu.
Từ kết quả bảng 3.2 cho thấy: đối với liều xạ 10 kR, tần số đột biến cây cao cao ở TD1 là 0,22 + 0,1, khi tăng liều xạ lên 15kR thì tần số đột biến TD1 là 0,32 + 0,13. Ở TTĐB, dưới tác dụng của phóng xạ đã xuất hiện một số dạng đột biến tăng chiều cao cây lúa với tần số tăng tỉ lệ thuận với liều xạ (0,15 + 0,08 ở 10 kR và 0,26 + 0,11 ở 15 kR). Chiều cao cây vào vụ xuân lên đến 160 – 170cm cao hơn 20-30 cm so với chiều cao trung bình của TTĐB dạng gốc (khoảng 145 cm). Ở TD 2.2 cũng đột biến cũng xuất hiện 3 cá thể có chiều cao 140-145cm so với dạng gốc là 120-125cm với tần số đột biến ở liều xạ 10 kR là 0,16 + 0,09.
Dưới tác dụng của tia phóng xạ, có lẽ đã xảy ra biến đổi trong kiểu gen của dạng gen khởi đầu là T-I- (kiểu hình dại), trong đó gen I át chế gen T và hai gen này thường ở trạng thái đồng hợp vì quá trình tự thụ phấn. Đột biến làm gen I biến thành gen i và làm xuất hiện kiểu gen TTIi ở một số hạt của cây M1, khi trồng qua M2 thì cho kiểu hình cây cao (kiểu hình đột biến).
Đột biến cây cao chỉ xuất hiện ở M2 chứng tỏ đây là đột biến lặn, loại đột biến này có tần số thấp hơn so với đột biến cây thấp và cũng tỉ lệ thuận với liều lượng chiếu xạ.
Hình 3.6 Đột biến chiều cao cây ở TD 2.2
TD 2.2
10kR TD 2.2 ĐC
TD 2.2 10kR
Hình 3.8 Biểu đồ tần số đột biến cây cao ở M2 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 TD 1 TTĐB TD 2.2 Giống TSĐ B f% ĐC 10 kR 15 kR
Như vậy, đột biến cây thấp và đột biến cây cao có xu hướng phát sinh tương tự nhau, tần số đột biến tỷ lệ thuận với liều lượng chiếu xạ. Nhận xét này của chúng tôi phù hợp với kết luận của Nguyễn Minh Công và cộng sự khi nghiên cứu hiệu quả của đột biến phóng xạ lên một số giống lúa Tám.
3.2.1.3. Đột biến về kích thước và màu sắc thân
Bảng 3.3. Sự phát sinh đột biến thân ở M2 do tác dụng của tia gamma nguồn Co60 trên TD1 và TD 2.2
Giống Liều lượng
Tổng số cá thể
Thân thấp, xanh đậm Thân nhỏ, màu tím Số lượng f% + m% Số lượng f% + m% TD 1 ĐC 1820 0 0 10 kR 1850 1 0,05 + 0,05