đột biến thực nghiệm trên thế giới và Việt Nam
* Trên thế giới:
Thành tựu đột biến tạo giống trên thế giới tập trung chủ yếu ở Châu Á, chiếm 86% giống mới tạo ra. Nhật Bản là nước đi tiên phong về bức xạ tạo giống và có ảnh hưởng lớn nhất đến thành tựu chung của Châu Á về công nghệ và đào tạo. Giống lúa nửa lùn Remei Nhật Bản, giống lúa đột biến Zhefu 802 của Trung Quốc là những thành tựu điển hình nhất [4].
Với phương pháp cổ điển, để tạo được một giống cây trồng mới năng suất cao, phẩm chất tốt và ổn định, phải cần từ 8-10 thế hệ. Trong khi đó, phương pháp chọn giống bằng gây đột biến thực nghiệm, một giống mới được tạo ra chỉ cần 3-6 thế hệ, thậm chí chỉ cần 2-3 thế hệ. [19]
Trên thế giới số lượng hạt giống cây trồng đột biến được tạo ra qua các năm ngày càng tăng trong đó trên 80% giống mới đột biến từ chiếu xạ [4]. Theo thống kê của tổ chức FAO/IAEA (Tổ chức lương thực và nông nghiệp/ Cơ quan
năng lượng nguyên tử Quốc Tế): năm 1960 mới chỉ có 7 giống lúa trồng đột biến mới được tạo ra bằng phương pháp gây đột biến thực nghiệm, đến năm 1965 là 30 giống. Năm 1969, tại hội thảo về vấn đề “Bản chất, tạo và sử dụng đột biến thực nghiệm ở thực vật” tổ chức tại Pullman (Mỹ), Sigurbonsson và Micke công bố 1330 giống cây trồng được tạo ra bằng đột biến thực nghiệm. Năm 1995, Maluszynski và cộng sự công bố 1790 giống đột biến. Đến tháng 12/1997 theo thống kê của Maluszynski và công sự công bố 1874 giống, trong đó các loài ngũ cốc chiếm 1357 giống, trong số này những giống trồng bằng hạt là 1284 giống. Trong số 1357 giống ngũ cốc, có 333 giống lúa và trong đó có những giống được công nhận trực tiếp từ những thể đột biến (chiếm 67%), số còn lại do kết hợp với phương pháp lai tạo. [19].
Nhiều giống có đặc điểm nông học quý rất được ưa chuộng nên được gieo trồng trên diện tích rộng. Ví dụ, giống lúa lùn Reimei (Nhật Bản) năm 1997 có diện tích gieo trồng là 120.000 ha, giống lúa lùn Nanjing No 34 9 (Trung Quốc) năm 1981 có diện tích gieo trồng là 120.000 ha. Năm 1982, giống lúa lùn Dongling No 3 (Trung Quốc) 120.000 ha, giống lúa chính sớm Yufanengzao (Trung Quốc) 1000.000 ha. Năm 1986, giống lúa năng suất cao Quinghuaai 6 (Trung Quốc) 240.000 ha [19].
* Ở Việt Nam:
Ngành chọn giống đột biến thực vật ở Việt Nam đã đạt được thành quả to lớn và đã có những đóng góp đáng kể trong việc nâng sản lượng lúa, ngô, đậu và nhiều cây trồng khác. Có khoảng 50 giống đột biến (lúa, đậu tương, hoa) đã được tạo ra và đưa vào sản xuất [10], trong đó có tới 28 giống lúa đột biến, và 17 giống được gây tạo nhờ chiếu xạ tia gamma. Ngoài việc khảo sát các dòng nhập nội, các nhà nghiên cứu Việt Nam đã có nhiều thành công trong việc đóng góp vào kho tàng lý luận và lý thuyết đột biến cũng như đạt được nhiều kết quả trong thực tiễn.
Công tác chọn tạo giống bằng ứng dụng tia phóng xạ gây đột biến đã được thực hiện ở nước ta từ những năm đầu thập kỷ 60 do Tiến sĩ Phan Phải, với sự
thành công đầu tiên là giống lúa DT1. Từ đó những kỹ thuật gây đột biến bằng ứng dụng kỹ thuật nguyên tử chủ yếu là dùng tia gamma (Co60) đã được sử dụng ở các liều lượng khác nhau vào các bộ phận thực vật khác nhau hoặc các thời điểm khác nhau đó chọn tạo ra được những giống cây lượng thực có giá trị trong sản xuất lượng thực các thập kỷ qua. Đặc biệt với liều lượng chiếu xạ thấp vào hạt đang nảy mầm hoặc bằng hóa chất NMU với nồng độ thích hợp đã tạo chọn được các giống lúa có năng suất cao, chống chịu tốt, chống chịu sâu bệnh và các điều kiện khó khăn mà bằng phương pháp lai tạo thông thường chưa đạt được kết quả. Có những giống tạo ra bằng phương pháp gây đột biến đã đóng góp đáng kể cho công tác sản xuất lương thực xuất khẩu ở các tỉnh phía Nam như giống TNDB-100, VNDD5-20, THDB. Có những giống đặc sản cho năng suất cao như Tám Xoan đột biến ở các tỉnh phía Bắc. Gần đây nhất, giống OM 2496 tạo ra từ đột biến được công nhận là giống Quốc gia với đặc điểm chịu mặn, năng suất cao, thơm, đem lại lợi nhuận gia tăng hàng năm ước tính 6 tỷ đồng/năm [4].
Trên cơ sở các nguồn gen tự nhiên đột biến đã sáng tạo ra các alen mới chưa tìm thấy trong tự nhiên, bước đầu đã có sự phối hợp chặt chẽ giữa kỹ thuật hạt nhân với nông học và sinh học. Từ năm 1995, Việt Nam đã trở thành thành viên của các nước chọn tạo giống bằng ứng dụng kỹ thuật hạt nhân đặc biệt tổ chức của các nước vùng Châu Á-Thái Bình Dương. Công tác tạo chọn giống bằng kỹ thuật gây đột biến lại được hỗ trợ của các tổ chức Quốc tế như cơ quan nguyên tử năng lượng Quốc tế IAEA và sự cộng tác có hiệu quả của Viện năng lượng nguyên tử Việt Nam-VAEC đã đưa công tác chọn tạo giống bằng phương pháp gây đột biến lên một bước mới.
Hiện nay hàng loạt dòng, giống đột biến được khảo nghiệm rộng rãi trên đồng ruộng, chắc chắn sẽ có những đóng góp thiết thực vào sản xuất cây lượng thực, thực phẩm trong thời gian tới.
Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu
Các giống lúa tẻ đối chứng:
• Tám thơm đột biến.
• Tám–Dự 1
• Tám–Dự 2.2
Các giống lúa trên được xử lý bằng tia gamma (nguồn Co60) ở các liều lượng phóng xạ: • Tám thơm đột biến: 10kR • Tám thơm đột biến: 15kR • Tám-Dự 1: 10 kR • Tám–Dự 1: 15 kR • Tám–Dự 2.2: 10 kR
Hạt của các giống lúa trên do PGS.TS Nguyễn Minh Công cung cấp.
2.1.1. Tám Thơm đột biến
Tám Thơm đột biến (TTĐB) do Trường Đại học Sư Phạm Hà Nội và Viện Di truyền Nông nghiệp tạo ra từ giống lúa gốc Tám Thơm Hải Hậu và được công nhận là giống lúa mới cấp quốc gia năm 2000. Một số đặc điểm hình thái, năng suất và chất lượng của giống lúa khảo nghiệm TTĐB được trình bày ở bảng 1 (Xem phụ lục)
2.1.2. Tám -Dự 1
Tám-Dự 1 (TD 1) là giống lúa thơm, được tạo ra từ tổ hợp lai giữa 2 dòng đột biến đã mất tính cảm quang, phát sinh từ 2 giống lúa đặc sản của tỉnh Nam Định: Dự Hải Hậu và Tám Xuân Đài (Dự đột biến số 2 và Tám Xuân Đài đột biến số 3), chọn lọc theo phương pháp phả hệ, có những đặc điểm ưu việt hơn hẳn so với bố mẹ (Xem phụ lục-bảng 2)
2.1.3. Tám-Dự 2.2
Tám-Dự 2.2 (TD 2.2) là một dòng thuộc giống lúa TD 2 cũng là giống lúa thơm được PGS-TS Nguyễn Minh Công và cộng sự tạo ra bằng phương pháp cho
lai giữa dòng Tám Xuân Đài đột biến số 3 và Dự đột biến số 2. Sau đó chọn lọc theo phương pháp phả hệ và cũng có những đặc điểm ưu việt hơn hẳn bố mẹ (Xem phụ lục-bảng 3)
2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Chuẩn bị hạt giống 2.2.1. Chuẩn bị hạt giống
Hạt giống được chọn có độ thuần cao.
Xử lý phóng xạ: hạt giống sau khi ngâm nước trong 24h sẽ được xử lí bằng tia phóng xạ gamma (nguồn Co60) ở M0 tại Trung tâm chiếu xạ Quốc gia Từ Liêm – Hà Nội.
Thu nhận hạt M1 và bắt đầu nghiên cứu ở M2.
2.2.2. Tiến hành thí nghiệm ngoài đồng ruộng
Tất cả các lô thí nghiệm đều được bố trí trên cùng thửa ruộng, điều kiện chăm sóc, dinh dưỡng như nhau. Việc bón phân, làm cỏ, phòng trừ sâu bệnh được tiến hành theo quy trình thí nghiệm khảo nghiệm giống lúa [2].
Lô đối chứng và các lô xử lý phóng xạ trong cùng một giống được gieo cạnh nhau.
Khoảng cách giữa các lô trong cùng một giống là 30 cm, giữa 2 lô của 2 giống khác nhau là 45cm. Khi mạ được 4-5 lá thật thì mang cấy, đảm bảo lúa được cấy thưa, đều và mật độ khoảng 35 cây/m2
.
Theo dõi các thời kỳ sinh trưởng và phát triển của các lô thí nghiệm. Phát hiện các biến đổi về hình thái lá, thân, dạng cây, bông, hạt, khả năng đẻ nhánh, thời gian sinh trưởng……so với đối chứng.
Chọn lọc các biến dị có lợi.
2.2.3. Phương pháp quan sát, mô tả hình thái và thu thập số liệu ở M2 liệu ở M2
Trong đề tài này,chúng tôi chỉ tiến hành thu thập số liệu theo các chỉ tiêu sau để nghiên cứu sự phát sinh đột biến ở thế hệ thứ hai (M2):
• Cây cao hơn hay thấp hơn cây cao nhất hoặc thấp nhất của đối chứng từ 10-20 cm trở lên được coi là đột biến cây cao hoặc đột biến cây thấp.
• Bông dài hoặc ngắn hơn bông dài nhất hoặc ngắn nhất ở lô đối chứng từ 3cm trở lên được coi là biến dị bông dài hoặc bông ngắn.
• Biến dị về màu sắc thân, lá, kiểu bông và hình dạng màu sắc hạt được xác định bằng mắt thường.
• Bông có hạt xếp gối bằng hoặc lớn hơn 1/3 hạt là biến dị bông có hạt xếp xít.
- Về chỉ tiêu khả năng đẻ nhánh:
• Khóm có số nhánh nhiều hơn khóm nhiều nhánh nhất của lô đối chứng từ 5 nhánh trở lên được coi là biến dị đẻ nhánh khỏe, còn khóm chỉ có 1-2 nhánh được coi là biến dị đẻ nhánh ít hoặc mất khả năng đẻ nhánh.
• Khóm chín sớm hoặc chín muộn hơn đối chứng từ 7-10 ngày trở lên được coi là biến dị chín sớm hoặc chín muộn.
- Về các yếu tố cấu thành năng suất:
• Khóm có số bông hữu hiệu nhiều hơn khóm nhiều bông nhất ở lô đối chứng từ 3 bông trở lên được coi là biến dị tăng số bông hữu hiệu.
• Bông có hạt nhiều hơn bông có hạt nhiều nhất ở lô đối chứng từ 30 hạt trở lên hoặc ít hơn 20 hạt trở lên được coi là biến dị tăng hoặc giảm số hạt/bông.
Tần số từng loại biến dị được xác định bằng tỉ lệ phần trăm giữa số lượng cá thể mang biến dị và tổng số cá thể trong lô sống đến thời điểm đó.
2.2.4. Phương pháp tính tần số biến dị đột biến phát sinh ở M2 M2
Tần số đột biến và thường biến phóng xạ được tính theo công thức của Vatti K.V và Tikhomirova M.M, 1979 [1],[10].
Sai số phần trăm: m% = + f% . (100 – f%) f: số cá thể mang biến dị trong lô n: tổng số cá thể trong lô nghiên cứu
2.2.5. Phương pháp khảo sát các dòng đột biến chín sớm, đẻ nhánh nhiều ở M3
2.2.5.1. Triển khai thí nghiệm ngoài đồng ruộng (M3)
Chúng tôi tiến hành gieo riêng một số thể đột biến chín sớm, đẻ nhánh nhiều, hạt to, hạt xếp xít và chiều dài bông tăng phát sinh ở M2 sang M3 nhằm nghiên cứu đặc điểm di truyền của các tính trạng có giá trị kinh tế cao. Hạt từ M2 được lấy từ các bông chính, gieo cạnh lô đối chứng, cấy một dảnh một khóm theo công thức 20x15cm, khi mạ được khoảng 15-20 ngày tuổi. Phương pháp bón phân, chăm sóc, phòng trừ sâu bệnh theo quy trình khảo nghiệm giống [2].
2.2.5.2. Phương pháp thu thập và xử lí số liệu
Các chỉ tiêu nông sinh học được xác định theo “Hệ thống tiêu chuẩn đánh giá cây lúa” của IRRI năm 1996 [11]. Một số tiêu chuẩn được cụ thể hóa theo hệ thống đánh giá tiêu chuẩn đối với lúa đang dùng trong khảo nghiệm lúa ở Việt Nam (xem phụ lục-bảng 4).
Đối với các tính trạng số lượng, dùng các công thức: - Trung bình của mẫu:
- Độ lệch chuẩn: δ = + với n > 30 δ = + với n < 30 n X = n ∑ fi . Xi ∑ fi .(Xi - X )2 n ∑ fi .(Xi - X )2 n - 1
- Sai số trung bình: m =
Trong đó: fi: Tần số các biến số cùng loại Xi: Giá trị các biến số
n: Số lượng cá thể trong mẫu
2.2.5.3. Phương pháp phân tích chất lương thóc gạo trong phòng thí nghiệm phòng thí nghiệm
Được thực hiện trong phòng thí nghiệm Sinh lý Thực vật và Sinh hóa thuộc khoa Sinh, Trường ĐHSP. TP. HCM.
Chuẩn bị mẫu: lúa được phơi khô, bóc vỏ, xay nhuyễn, đem sấy 2h ở 800C, sau đó sấy liên tục ở 650C, đem đi cân cho đến khi trọng lượng không đổi (mẫu khô tuyệt đối ).
Phương pháp xác định các chỉ tiêu sinh hóa: - Xác định hàm lượng amylose:
Xác định theo phương pháp của IRRI (Perez và Juliano, 1981) (Lê Doãn Diên, 2002) [4]. Cân chính xác 100mg mẫu cho vào bình tam giác 200ml rồi cho vào đó 6,6 ml NaOH 1N. Lắc đều rồi để qua đêm ở nhiệt độ phòng. Sáng hôm sau dùng đũa thủy tinh khuấy đều, cho nước cất vào cho đến 100 ml. Lấy 10 ml dung dịch ( đã khuấy đều) cho vào bình tam giác dung tích 200ml ( bình có vạch đo mực nước) rồi cho nước cất đến vạch 150 ml, trung hòa bằng HCl 1N cho đến lúc pH =5 thêm vào đó 2 ml dung dịch Lugol lắc đều rồi lấy 25 ml dung dịch thu được pha sao cho tổng thể tích bằng150ml. Lắc đều, cho vào Cuvet đưa lên máy đo quang phổ đo ở bước sóng 700nm ta sẽ được độ hấp phụ tinh bột. Sau đó so với đường chuẩn ta sẽ biết được lượng tinh bột trong mẫu
Công thức: A x a % Amylose = x 100 g δ √n
A: hàm lượng amylose đo trên máy quảng phổ (mg/l) a: nồng độ pha loãng
g: khối lượng mẫu nghiên cứu (mg)
Phân loại gạo dựa trên hàm lượng amylose trong tinh bột (Xem phụ lục– bảng 5)
- Xác định hàm lượng protein:
Các dạng Nitrogen trong gạo được xác định trên cơ sở protein thô (N tổng số, N phi protein) bằng phương pháp Micro-Kjeldahl (Yoshida et al.,1976, Lê Doãn Liên, 2002 [4]. Hàm lượng protein được tính ra bằng cách nhân hàm lượng của Nitrogen tổng số: % protein thô = %Nts x 6.5
- Độ hóa hồ:
(Theo phương pháp của Little và cộng sự (1958)
Độ hoá hồ được xác định bằng dung dịch KOH 1.7% trong 23h ở nhiệt độ là 300C: Dùng đĩa petri xếp 6 hạt gạo trắng vào mỗi hộp, xếp các hạt tách ra để khi tan ra chúng không chạm vào nhau. Cho 10 ml KOH 1.7% vào, đậy nắp hộp và để yên trong 23h.
Đánh giá độ hóa hồ theo tiêu chuẩn hệ thống đánh giá mẫu của IRRI, 1996 ( Xem phụ lục-bảng 6)
- Độ bền thể gel:
(Theo phương pháp của Tang và cộng sự, 1991)
Các mẫu để cùng phòng 2 ngày cho độ ẩm bằng nhau, nghiền mẫu và rây thành bột mịn 100 mesh.
Cân mỗi mẫu 100mg cho vào ống nghiệm 13x100mm (mỗi mẫu lặp lại 3 lần). Cho vào ống nghiệm 0,2 ml ethanol 95% có chứa 0,025% Thymol blue. Thêm 2ml KOH 0,2N. Lắc trên máy Vortex genie ở tốc độ 6 để trộn, bịt ống nghiệm bằng giấy nhôm.
Đun các ống nghiệm trong nồi chưng cách thủy đang sôi trong 8 phút rồi lấy ra để yên 5 phút, sau đó làm lạnh trong nước đá 20 phút.
Đặt các ống nghiệm nằm ngang trên giấy kẻ ô, để gel chảy từ từ. Sau 1 giờ đọc kết quả: đo chiều dài gel từ đáy ống nghiệm đến mí gel.
Phân loại gel theo IRRI, 1996 [7] (Xem phụ lục-bảng 7).
2.3. Địa điểm và thời gian nghiên cứu 2.3.1. Địa điểm nghiên cứu 2.3.1. Địa điểm nghiên cứu
Gây đột biến phóng xạ tại Trung tâm chiếu xạ Quốc gia Từ Liêm – Hà Nội.
Địa điểm gieo trồng và theo dõi tại đồng ruộng xã Hiệp Tân, huyện Hòa Thành, tỉnh Tây Ninh
2.3.2. Thời gian nghiên cứu
Thời gian thực hiện luận văn khoảng 12 tháng từ 11/2010 – 10/201 (vụ xuân và vụ mùa năm 2011).
Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. Ảnh hưởng của liều chiếu xạ nguồn Co60lên tỷ lệ sống sót thời kì mạ, đẻ nhánh và trổ chín trên các giống lúa nghiên cứu
Tỷ lệ sống sót qua các thời kì phản ánh rõ rệt nhất tác động hủy hoại của tia gamma lên mô, tế bào và sức sống của cơ thể. Khi chiếu xạ lên hạt khô, các tác giả đều thống nhất kết luận: liều lượng thấp có tác dụng kích thích hạt nảy