4.3.1. Hoạt tính gây độc tế bào
Từ kết quả trên Bảng 3.1 cho thấy dịch chiết methanol của cây xáo leo (P. scandens) có hoạt tính gây độc tế bào trên cả 2 dòng tế bào ung thư Hep-G2 và RD với IC50 lần lượt là 6,45 và 13,88 g/ml, đặc biệt trên dòng tế bào ung thư gan Hep- G2 có hoạt tính mạnh hơn.
Kết quả thử hoạt tính diệt tế bào ung thư in vitro của hai hợp chất tirucallan mới paramignyol A và paramignyol B bằng phương pháp thử SRB được thể hiện trong bảng 4.20:
Bảng 4.20. Kết quả hoạt tính kháng tế bào ung thư in vitro của Paramignyol A và Paramignyol B
Dòng tế bào ung thư người
Giá trị IC50 (µM)
Paramignyol A Paramignyol B Ellipticine
KB (biểu mô) 6,43±0,17 5,25±0,17 2,07±0,28 SK-Mel-2 (hắc tố) 6,02±0,17 3,55±0,15 1,09±0,24 LU-1 (phổi) 10,50±0,17 6,48±0,17 1,75±0,24 MCF7 (vú) 7,22±0,23 5,98±0,09 1,87±0,20 Như vậy hai hợp chất mới là Paramignyol A và Paramignyol B đều có hoạt tính kháng tế bào ung thư trên cả 4 dòng ung thư biểu mô - KB, ung thư hắc tố SK- Mel-2, ung thư phổi LU-1 và ung thư vú MCF7, trong đó hợp chất Paramignyol B có hoạt tính mạnh hơn Paramignyol A.
Tuy nhiên, ở nồng độ 100 µg/ml, 05 dẫn xuất tirucallan glycosit mới, Paramignyoside AE, không có biểu hiện hoạt tính gây độc tế bào trên 04 dòng tế bào ung thư được thử nghiệm là KB, SK-Mel2, LU-1 và MCF7.
Trên cơ sở kết quả hoạt tính gây độc tế bào, hai hợp chất Paramignyol A và B được lựa chọn để đánh giá tiếp theo về khả năng kích hoạt enzyme caspase 3/7 trên dòng tế bào ung thư LU-1.
1 2 3 0 5 0 0 0 1 0 0 0 0 1 5 0 0 0 2 0 0 0 0 2 5 0 0 0 2 0 g / m l 3 5g / m l 7 . 0 g / m l 1 . 4 g / m l 0 . 2 8 g / m l T a m o x i f e n P a r a m ig n y o l A P a g r a m i g n y o l B C a s p a s e a c ti v it y ( R F U )
Kết quả thu được cho thấy, hợp chất Paramignyol A thể hiện khả năng kích hoạt enzyme caspase 3/7 mạnh ở các nồng độ thử nghiệm so với chất đối chứng dương Tamoxifen. Hợp chất Paramignyol B cũng thể hiện hoạt tính kích hoạt enzyme caspase tuy nhiên khả năng này yếu hơn Paramignyol A và chỉ thể hiện rõ ở nồng độ thử nghiệm là 7 µg/ml.
Apoptosis là một quá trình tự chết của tế bào được lập trình (programmed cell death - PCD) xảy ra trong các sinh vật đa bào. Sự ức chế apoptosis có thể dẫn đến nhiều loại bệnh ung thư, bệnh tự miễn dịch, bệnh sưng viêm và bệnh do nhiễm virút. Ban đầu việc số lượng các tế bào tăng bất thường và tạo ra khối u được cho là do việc sinh sôi nảy nở của tế bào tăng sinh mạnh; tuy nhiên hiện nay các nghiên cứu cho thấy việc suy giảm tốc độ chết của tế bào cũng là nguyên nhân của hiện tượng này. Loại bệnh phổ biến nhất trong nhóm này là ung thư, một căn bệnh trong đó tế bào sản sinh quá mức, thông thường được mô tả như là sự biểu hiện quá mức của họ protein ức chế apoptosis của tế bào (IAP). Do vậy các nhà khoa học hiện nay cũng đang theo hướng sàng lọc các hoạt chất có khả năng điều trị ung thư theo cơ chế cảm ứng và kích hoạt quá trình apoptosis.
Nhiều nghiên cứu cho thấy họ enzyme caspase đóng vai trò trung tâm trong việc truyền tín hiệu apoptosis. Cho đến nay đã có 15 loại caspase được chia thành 2 nhóm chính là caspase gây viêm và caspase liên quan đến apoptosis (bao gồm caspase 2, 3, 6, 7, 8, 10, 15). Trong đó caspase 3, 7 tham gia vào quá trình cắt các protein khác trong tế bào, mở đầu cho quá trình apoptosis. Các caspase này sẽ thực hiện quá trình chết tế bào theo chu trình apoptosis. Việc xác định khả năng kích hoạt enzyme caspase có thể cho ta biết cơ chế tác động của một số hoạt chất có tiềm năng điều trị ung thư.
Kết quả thu được cho thấy, hợp chất tirucallan mới Paramignyol A thể hiện hoạt tính gây độc tế bào mạnh trên 04 dòng tế bào ung thư được thử nghiệm là KB, SK-Mel2, LU-1 và MCF7 đồng thời thể hiện khả năng kích thích mạnh enzyme caspase 3/7 ở tế bào LU-1. Như vậy, hợp chất này có nhiều tiềm năng cho các nghiên cứu tiếp tục theo định hướng kháng ung thư.
4.3.2. Hoạt tính kháng viêm
Năm hợp chất tirucallan glycosit mới Paramignyoside AE đã được thử hoạt tính kháng viêm và thực nghiệm được tiến hành tại Khoa Dược, Đại học quốc gia Chungnam, Hàn Quốc. Kết quả thể hiện trên Bảng 4.21.
Bảng 4.21. Hoạt tính kháng viêm của các hợp chất Paramignyoside A-E
Hợp chất Giá trị IC50 (µM) IL-12 p40 IL-6 TNF-α Paramignyoside A 48,68 >50 >50 Paramignyoside B 29,15 >50 >50 Paramignyoside C 5,03 >50 >50 Paramignyoside D 19,59 >50 >50 Paramignyoside E 14,09 >50 >50 Chứng dương SB203580 5,00 3,50 7,20
Từ kết quả trên cho thấy cả 5 hợp chất đều có hoạt tính ức chế quá trình tạo ra IL-12 p40 trong đó hợp chất paramignyoside C có hoạt tính tương đương chất chuẩn dương SB203580. Do đó cần nghiên cứu tiếp theo về cơ chế kháng viêm cũng như hoạt tính in vivo trong thời gian tới của các hợp chất này, đặc biệt là hợp chất paramignyoside C.
4.4. Tổng hợp các hợp chất phân lập từ cây xáo leo – P. scandens
Bằng các phương pháp sắc ký, từ cây xáo leo – P. scandens đã phân lập được 19 hợp chất, trong đó có 7 hợp chất mới và 12 hợp chất đã biết. Kết quả tổng hợp cấu trúc và tên gọi của 19 hợp chất này được trình bày trong bảng 4.22.
Bảng 4.22.Tổng hợp các hợp chất phân lập từ cây xáo leo – P. scandens
Paramignyoside A (03) (Chất mới): R = H
Paramignyoside B (04) (Chất mới): R = Ac
Paramignyoside C (05) (Chất mới)
Paramignyoside D (06) (Chất mới): R = H
Paramignyoside E (07) (Chất mới): R = Ac
-D-glucopyranoside methyl salicylate (10) Adenosine (11) 1,1-Dimethylprop-2-enyl 1-O-β-D- glucopyranoside (12) Syringin (13) Atripliside B (14)
trans-N-p-coumaroyl tyramine (15)
Gusanlungionoside C (17)
Betulalbuside B (18)
2,6-dimethoxy-4[(1E)-prop-1- enyl]phenyl O--L-rhamno-pyranosyl-
(16)--D-glucopyranoside (16) Syringaresinol di-O--D- glucopyranoside (19)
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
Từ cây xáo leo – Paramignya scandens (Griff.) Craib. (Rutaceae) thu ở Lâm Đồng, bằng các phương pháp sắc ký đã tách chiết và xác định cấu trúc của 19 hợp chất, trong đó có 7 hợp chất mới đều thuộc dạng khung tirucallan: Paramignyol A, Paramignyol B, Paramignyoside A, Paramignyoside B, Paramignyoside C, Paramignyoside D, Paramignyoside E và 12 hợp chất đã được phân lập từ các loài thực vật khác: Methyl isolimonate, 6R,9S-Roseoside, -D-glucopyranoside methyl salicylate, Adenosine, 1,1-Dimethylprop-2-enyl 1-O-β-D-glucopyranoside, Syringin, Atripliside B, Betulalbuside B, trans-N-p-coumaroyl tyramine, 2,6- dimethoxy-4[(1E)-prop-1-enyl]phenyl O--L-rhamno-pyranosyl-(16)--D- glucopyranoside, Gusanlun-gionoside C, Syringaresinol di-O--D-glucopyranoside. Hai hợp chất mới Paramignyol A và Paramignyol B có hoạt tính gây độc tế bào trên 4 dòng ung thư biểu mô - KB, ung thư hắc tố SK-Mel-2, ung thư phổi LU- 1 và ung thư vú MCF7, trong đó hợp chất Paramignyol B có hoạt tính mạnh hơn Paramignyol A. Ngoài ra, Paramignyol A thể hiện khả năng kích thích mạnh enzyme caspase 3/7 ở tế bào LU-1.
Năm hợp chất mới Paramignyoside A-E có hoạt tính kháng viêm, trong đó hợp chất Paramignyoside C có hoạt tính mạnh nhất.
Đây là nghiên cứu đầu tiên về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài P. scandens ở Việt Nam và trên thế giới. Dựa trên các kết quả thu được cho thấy cây Xáo leo có khả năng phát triển thành nguyên liệu cho ngành công nghiệp dược ở nước ta. Cho nên cần có kế hoạch để bảo tồn và phát triển loài cây này.
DANH MỤC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN
1. Nguyen Huu Toan Phan, Nguyen Thi Dieu Thuan, Ninh Thi Ngoc, Pham Thi Mai Huong, Nguyen Phuong Thao, Nguyen Xuan Cuong, Nguyen Van Thanh, Nguyen Hoai Nam, Phan Van Kiem, Chau Van Minh (2014), “Two tirucallane derivatives from Paramignya scandens and their cytotoxic activity”,
Phytochemistry Letters, 9, pp. 78–81.
2. Nguyen Huu Toan Phan, Nguyen Thi Dieu Thuan, Ninh Thi Ngoc, Nguyen Phuong Thao, Sohyun Kim, Young Sang Koh, Nguyen Van Thanh, Nguyen Xuan Cuong, Nguyen Hoai Nam, Phan Van Kiem, Young Ho Kim, Chau Van Minh (2015), “Anti-inflammatory tirucallane saponins from Paramignya scandens”, Chem. Pharm. Bull., 63(7), đang chờ in.
3. Nguyễn Thị Diệu Thuần, Nguyễn Hữu Toàn Phan, Nông Văn Duy, Ninh Thị Ngọc, Nguyễn Văn Thanh, Nguyễn Xuân Cường, Nguyễn Hoài Nam, Phan Văn Kiệm, Châu Văn Minh (2014), “Các hợp chất glycosit phân lập từ cây Xáo leo Paramignya scandens”, Tạp chí Khoa học và Công nghệ, 52(5A), tr. 69-75.
4. Nguyễn Thị Diệu Thuần, Nguyễn Hữu Toàn Phan, Nông Văn Duy, Ninh Thị Ngọc, Nguyễn Văn Thanh, Nguyễn Xuân Cường, Nguyễn Hoài Nam, Phan Văn Kiệm, Châu Văn Minh (2015), “Nghiên cứu thành phần hóa học của cây xáo leo - Paramignya scandens”, Tạp chí Hóa học, 53(1), tr. 84-89.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Phan Văn Đệ, Trần Công Luận, Điều tra, đánh giá nguồn tài nguyên dược liệu tỉnh Lâm Đồng và định hướng phát triển một số loài đặc hữu có giá trị kinh tế cao, Báo cáo kết quả nghiên cứu đề tài KHCN, Sở KH-CN tỉnh Lâm Đồng,
2011, 60-62.
2. Đỗ Thị Thảo, Trịnh Thị Thanh Vân, Nguyễn Quyết Chiến, Nguyễn Văn Hùng, Đỗ Khắc Hiếu, Nghiên cứu in vitro hoạt chất kháng ung thư của cây bán liên chi (Scutellaria barbata D. Don), Tạp chí Dược học, 2005,355 10-13.
3. Nam, N.H., H.M. Kim, K.H. Bae, and B.Z. Ahn, Inhibitory effects of Vietnamese medicinal plants on tube-like formation of human umbilical venous cells, Phytother Res, 2003,17 (2), 107-111.
4. Giang, P.M., P.T. Son, Y. Hamada, and H. Otsuka, Cytotoxic Diterpenoids from Vietnamese Medicinal Plant Croton tonkinensis Gagnep, Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 2005,53 (3), 296-300.
5. Nguyễn Hữu Toàn Phan, Nghiên cứu hoá học một số cây thuốc chọn lọc Việt Nam có hoạt tính chống ung thư, 2009.
6. Sung, T.V., T.V. Loc, T.D. Quan, T.V. Chien, N.T. Anh, T.T. Thuy, N.T.H. Anh, P.T. Ninh, N.H.T. Phan, and N.T.D. Thuan. Study on Taxol and Taxotere synthesis using 10-deacetylbaccatin III isolated from Taxus wallichiana
growing in Lamdong province, Vietnam, in The First VAST - KOGI Workshop on Science and Technology R&D Cooperation. 2007, NXB Khoa học và Công nghệ, Hanoi.
7. Yang, Q.X. and C.R. Yang, Cytotoxic steroidal saponins from Polygonatum punctatum, Chem Biodivers, 2006,3 (12), 1349-1355.
8. Wu, J.J., K.W. Cheng, X.F. Zuo, M.F. Wang, P. Li, L.Y. Zhang, H. Wang, and W.C. Ye, Steroidal saponins and ecdysterone from Asparagus filicinus and their cytotoxic activities, Steroids, 2010,75 (10), 734-739.
9. Zhang, D.X., T.G. Hartley, and D.J. Mabberley., Rutaceae, Flora of China,
2008,11 88.
10. Viện Sinh thái & Tài nguyên Sinh vật – Trung tâm Khoa học tự nhiên và Công nghệ quốc gia, Danh lục các loài thực vật Việt Nam, Tập 2. 2003, Nxb Nông nghiệp.
11. Phạm Hoàng Hộ, Cây cỏ Việt Nam, Quyển 2. 2003, Nxb. Trẻ.
12. Võ Văn Chi, T.H., Cây cỏ có ích ở Việt Nam. 1999, Nxb. Giáo dục, Hà Nội. 13. Cheng, J.T., Y.Q. Han, J. He, X. De Wu, L.B. Dong, L.Y. Peng, Y. Li, and Q.S.
Zhao, Two new tirucallane triterpenoids from the leaves of Aquilaria sinensis,
Arch Pharm Res, 2013,36 (9), 1084-1089.
14. Ntalli, N.G., F. Cottiglia, C.A. Bueno, L.E. Alche, M. Leonti, S. Vargiu, E. Bifulco, U. Menkissoglu-Spiroudi, and P. Caboni, Cytotoxic tirucallane triterpenoids from Melia azedarach fruits, Molecules, 2010,15 (9), 5866-5877. 15. Yang, S.-M., Q.-S. Song, C. Qing, D.-G. Wu, and X.-K. Liu, Anticancer
Activity of Tirucallane Triterpenoids from Amoora dasyclada, Z. Naturforsch,
2006,61c, 193-195.
16. Chen, H., S.G. Ma, Z.F. Fang, J. Bai, S.S. Yu, X.G. Chen, Q. Hou, S.P. Yuan, and X. Chen, Tirucallane triterpenoids from the stems of Brucea mollis, Chem Biodivers, 2013,10 (4), 695-702.
17. Hu, J., Y. Song, H. Li, B. Yang, X. Mao, Y. Zhao, and X. Shi, Cytotoxic and anti-inflammatory tirucallane triterpenoids from Dysoxylum binectariferum,
Fitoterapia, 2014,99 86-91.
18. Kumar, V., N.M.M. Niyaz, S. Saminathan, and D.B.M. Wickramaratne, Coumarins from Paramignya monophylla root bark, Phytochemistry, 1998, 49
(1), 215-218.
19. A., J.D.M., Medicinal Plants (Indigenous and Exotic) Used in Ceylon, Part V. Colombo, A publication of the National Science Council of Sri Lanka, 1982. 20. Kumar, V., N.M.M. Niyaz, and D.B.M. Wickramaratne, Coumarins from stem
21. Kumar, V., N.M.M. Niyaz, D.B.M. Wickramaratne, and S. Balasubramaniam, Tirucallane derivatives from Paramignya monophylla fruits, Phytochemistry,
1991,30 (4), 1231-1233.
22. Wattanapiromsakul, C. and P.G. Waterman, Flavanone, triterpene and chromene derivatives from the stems of Paramignya griffithii, Phytochemistry, 2000, 55
(3), 269-273.
23. Wiart, C., Medicinal Plant of Asia-Pacific-Drugs for the Future. Vol. Library Cataloguing-in-Publication Data, 2006, World Scientific Publishing Co. Pte. Ltd., British, 380.
24. Nguyễn Minh Khởi, Phạm Thị Nguyệt Hằng, Đỗ Thị Phương, Nghiên cứu độc tính cấp tác dụng bảo vệ gan và tác dụng gây độc tế bào ung thư của xáo tam phân, Tạp chí Dược liệu, 2013,18 (1), 14 - 20.
25. Phạm Huy Bích, Nguyễn Thị Bích Thu, Nguyễn Minh Khởi, Phân lập và định lượng Ostruthin trong dược liệu xáo tam phần thu hái tại Việt Nam, Tạp chí Dược liệu, 2013,18 (3), 173 - 179.
26. Trần Thị Thúy Quỳnh, Lê Thị Kim Thoa, Phạm Đông Phương, Phân lập một số hợp chất coumarin trong rễ xáo tam phân (Paramignya trimera (Oliv.) Burkill),
Tạp chí Dược học, 2014,457, 11.
27. Trần Thị Thúy Quỳnh, Nguyễn Trung Dũng, Phạm Đông Phương, Phân lập một vài hợp chất acridon alkaloid trong rễ xáo tam phân (Paramignya trimera
(Oliv.) Burkill), Tạp chí Dược học, 2014,458, 60-64.
28. Liu, Y. and P. Abreu, Tirucallane triterpenes from the roots of Ozoroa insignis,
Phytochemistry, 2006,67 (13), 1309-1315.
29. Liu, H.B., C.R. Zhang, S.H. Dong, L. Dong, Y. Wu, and J.M. Yue, Limonoids and triterpenoids from the seeds of Melia azedarach, Chem Pharm Bull (Tokyo),
2011,59 (8), 1003-1007.
30. Luo, X.-D., S.-H. Wu, Y.-B. Ma, and D.-G. Wu, Tirucallane triterpenoids from
31. Xie, B.J., S.P. Yang, H.D. Chen, and J.M. Yue, Agladupols A-E, triterpenoids from Aglaia duperreana, J Nat Prod, 2007,70 (9), 1532-1535.
32. Yang, S.-M., L. Ding, Shao-HuaWu, Y.-B. Ma, X.-D. Luo, and Da-GangWu, Two New Tirucallane Triterpenes with Six-Membered Hemiacetal from
Amoora dasyclada, Z. Naturforsch., 2004,59b 1067-1069.
33. Koo, J.E., H.J. Hong, A. Dearth, K.S. Kobayashi, and Y.S. Koh, Intracellular invasion of Orientia tsutsugamushi activates inflammasome in asc-dependent manner, PLoS One, 2012,7 (6), e39042.
34. Bowen, I.H. and Y.N. Patel, Phytochemical analysis of the leaves and stems of
Paramignya monophylla Wight (Rutaceae), Journal of Pharmacy and Pharmacology, 1998,50 (S9), 232-232.
35. Liu, J., S.P. Yang, G. Ni, Y.C. Gu, and J.M. Yue, Triterpenoids from Aglaia odorata var. microphyllina, J Asian Nat Prod Res, 2012,14 (10), 929-939. 36. Zi, J., S. Li, M. Liu, M. Gan, S. Lin, W. Song, Y. Zhang, X. Fan, Y. Yang, J.
Zhang, J. Shi, and D. Di, Glycosidic constituents of the tubers of Gymnadenia conopsea, J Nat Prod, 2008,71 (5), 799-805.
37. Yuan, C.M., Y. Zhang, G.H. Tang, Y. Li, H.P. He, S.F. Li, L. Hou, X.Y. Li, Y.T. Di, S.L. Li, H.M. Hua, and X.J. Hao, Cytotoxic limonoids from Melia azedarach, Planta Med, 2013,79 (2), 163-168.
38. Kurimoto, S., Y. Takaishi, F.A. Ahmed, and Y. Kashiwada, Triterpenoids from the fruits of Azadirachta indica (Meliaceae), Fitoterapia, 2014,92 200-205. 39. O'Neill, M.J., J.A. Lewis, H.M. Noble, S. Holland, C. Mansat, J.E. Farthing, G.
Foster, D. Noble, S.J. Lane, P.J. Sidebottom, S.M. Lynn, M.V. Hayes, and C.J. Dix, Isolation of translactone-containing triterpenes with thrombin inhibitory activities from the leaves of Lantana camara, J Nat Prod, 1998, 61 (11), 1328- 1331.
40. Swinny, E.E., A novel acetylated 3-deoxyanthocyanidin laminaribioside from the fern Blechnum novae-zelandiae, Z Naturforsch C, 2001,56 (3-4), 177-180.
41. Han, M.L., Y. Shen, G.C. Wang, Y. Leng, H. Zhang, and J.M. Yue, 11beta- HSD1 inhibitors from Walsura cochinchinensis, J Nat Prod, 2013,76 (7), 1319- 1327.
42. Corea, G., E. Fattorusso, and V. Lanzotti, Saponins and flavonoids of Allium triquetrum, J Nat Prod, 2003,66 (11), 1405-1411.
43. Cheplogoi, P.K., D.A. Mulholland, P.H. Coombes, and M. Randrianarivelojosia, An azole, an amide and a limonoid from Vepris uguenensis (Rutaceae), Phytochemistry, 2008,69 (6), 1384-1388.
44. Bennett, R.D. and S. Hasegawa, Isolimonic acid, a new citrus limonoid,
Phytochemistry, 1980,19 (11), 2417-2419.
45. Yamano, Y. and M. Ito, Synthesis of optically active vomifoliol and roseoside