Nuôi tế bào ung thư in vitro theo Skehan và cs. Xác định hoạt tính gây độc các dòng tế bào ung thư theo phương pháp SRB của Likhiwitayawuid và cs. đang được tiến hành tại Viện Nghiên cứu Ung thư Quốc gia của Mỹ (NCI). Phương pháp này
đã được phòng Sinh học Thực nghiệm thuộc Viện Hoá học các Hợp chất Thiên nhiên áp dụng từ năm 1996. Phép xác định gồm hai bước như sau:
Bước 1: Sàng lọc tìm các mẫu thử có hoạt tính
Chuẩn bị tế bào
- Dòng tế bào được lưu giữ trong nitơ lỏng, hoạt hóa và duy trì trong các môi trường dinh dưỡng MEME, Eagle hoặc DMEM.
- Tế bào được nuôi trong các điều kiện tiêu chuẩn (CO2 5%; độ ẩm 98%; nhiệt độ 37oC, vô trùng tuyệt đối), tế bào được hoạt hoá trước khi thí nghiệm tiến hành từ 18-24 giờ.
- Dùng dung dịch tripsin versel 0,1% để tách tế bào sau khi đã rửa tế bào bằng đệm PBS. Pha tế bào bằng môi trường sạch, đếm số lượng, tạo huyền dịch tế bào ở nồng độ thí nghiệm (khoảng 3-5x104 tế bào/ml tùy theo từng loại tế bào thử nghiệm).
Chuẩn bịmẫu thử
- Pha mẫu gốc (4 mg/mL) từ mẫu chiết thực vật trong dung môi dimethyl sulphoxide (DMSO). Do DMSO biểu hiện độc tính ở nồng độ cao, nên cần hòa loãng với môi trường ở nồng độ nhỏ.
Tiến hành thí nghiệm
- Nhỏ vào các giếng của phiến thí nghiệm theo sơ đồ như sau: + Dãy đối chứng âm: DMSO 10%
+ Dãy đối chứng dương: chất chuẩn có khả năng diệt tế bào (ellipithine 0,01mM trong DMSO)
+ Dãy thí nghiệm: mẫu thử + dịch huyền phù tế bào - Phiến được ủ trong tủ CO2 ở 37oC trong 3 ngày.
Kết thúc thí nghiệm
- Tế bào sau khi ủ 3 ngày được cố định bằng dung dịch TCA lạnh. Rửa, để khô, nhuộm SRB 0,4% trong axit axetic 1% và rửa lại bằng axit axetic 1% để loại màu thừa; để khô, hoà lại bằng dung dịch đệm Trisbazơ 10M trên máy lắc ngang.
Tính kết quả
- Tính giá trị CS % (% Cell Survival)
Giá trị CS là khả năng sống sót của tế bào ở nồng độ ban đầu của mẫu thử, mẫu nào cho giá trị CS ≤ 50% thì được đánh giá là có hoạt tính.
Giá trị CS(%) được tính theo công thức:
Trong đó: OD: mật độ quang σ: độ lệch tiêu chuẩn - Độ lệch σ được tính theo công thức:
Trong đó: xi : giá trị OD tại giếng i; : giá trị OD trung bình; n: số giếng thử lặp lại Các mẫu có biểu hiện hoạt tính (CS50 ≤ 50% ± ) sẽ được chọn ra cho thử nghiệm bước 2 để tìm giá trị IC50.
Bước 2: Tìm giá trị IC50
Dùng giá trị CS% của 10 nồng độ, dựa vào chương trình Table curve theo thang giá trị logarit của đường cong phát triển tế bào và nồng độ chất thử để tính giá trị IC50. Các mẫu thô có giá trị IC50 ≤ 40 µg/ml được coi là có hoạt tính.
Các mẫu tinh có giá trị IC50 ≤ 20 µg/ml được coi là có hoạt tính.