Cặn chiết cloroform (40g) cho qua cột hấp phụ Silicagel dùng hệ dung môi giải hấp CH2Cl2-MeOH tăng dần nồng độ MeOH từ 0 đến 100% cho 8 phân đoạn từ C1-C8.
Phân đoạn C4 tiếp tục cho qua cột silica gel pha đảo với hệ dung môi giải hấp là MeOH-H2O=2/1 thu được 3 phân đoạn C4A (130 mg), C4B (400 mg), C4C (25 mg).
Phân đoạn C4B sau khi qua cột Sephadex LH-20 với hệ MeOH-H2O (2/1) thu được các phân đoạn C4B1, C4B2, C4B3. Hợp chất PS01 (30 mg) được tinh chế từ phân đoạn C4B3.
Từ phân đoạn C5 (4,7g) tiếp tục cho qua cột hấp phụ Silica gel dùng hệ dung môi giải hấp CH2Cl2-MeOH gradient tỷ lệ tăng dần từ 25/1đến 0/100 cho 4 phân đoạn từ C5A-C5D. Phân đoạn C5A (1,2 g) cho qua cột silica gel pha đảo với hệ
dung môi giải hấp là MeOH-H2O (1/1) thu được C5A2 tuy nhiên chất này trùng với PS01. Phân đoạn C5B (2 g) cho qua cột silica gel pha thường giải hấp với hệ dung môi hexan-ethyl axetat (5/1) thu được 5 phân đoạn từ C5B1-C5B5. Phân đoạn C5B1 (46 mg) cho qua cột Sephadex LH-20 với hệ MeOH-H2O (2/1) thu được C5B1A (26 mg), tiếp tục qua cột silica gel pha đảo với hệ dung môi giải hấp là MeOH-H2O (8/1) thu được hai chất PS15 (10 mg) và PS16 (5 mg). Tương tự hợp chất PS18 (5 mg) thu được từ phân đoạn C5B5 (46 mg) sau khi qua cột silica gel pha thường giải hấp với hệ dung môi CH2Cl2-MeOH (15/1).
Phân đoạn C8 (2,5 g) cho qua cột silica gel pha thường giải hấp với hệ dung môi hexan-ethyl axetat (2/1) tiếp tục thu được 5 phân đoạn từ C8A-C8G. Phân đoạn C8G (240 mg) cho qua cột silica gel pha thường giải hấp với hệ dung môi CH2Cl2-MeOH (10/1) thu được hợp chất PS09 (4 mg).
Lớp nước được tiến hành phân tách thô trên cột sắc ký với chất nhồi là Diaion HP-20 với hệ dung môi giải hấp tăng dần nồng độ MeOH trong nước cất (0%, 30%, 70% và 100%), loại bỏ phần rửa giải bằng nước 100% thu được ba phân đoạn ký hiệu là W1-W3.
Phân đoạn W1 (9g) được phân tách thành 05 phân đoạn nhỏ ký hiệu là W1A- W1E bằng sắc ký cột silica gel pha thường giải hấp bằng CHCl3/MeOH (20/1-0/1).
Phân đoạn W1B (350 mg) được cho qua cột silica gel pha đảo với hệ dung môi giải hấp là MeOH-H2O (1/3) thu được 3 phân đoạn từ W1B1 - W1B3, phân đoạn W1B3 (29 mg) tiếp tục cho qua cột silica gel pha thường giải hấp với hệ dung môi CHCl3/MeOH/H2O (9/1/0,03) thu được hợp chất sạch ký hiệu là PS03 (6 mg).
Bằng phương pháp tương tự, phân đoạn W1C (1,3 g) được cho qua cột silica gel pha đảo với hệ dung môi giải hấp là MeOH-H2O (1/4) thu được 4 phân đoạn từ W1C1-W1C4, phân đoạn W1C2 (700 mg) tiếp tục cho qua cột Sephadex LH-20 MeOH-H2O (1/2) thu được 5 phân đoạn từ W1C2A-W1C2F, phân đoạn W1C2A (85 mg) cho qua cột silica gel pha thường giải hấp với hệ dung môi CHCl3/ MeOH/H2O (7/1/0,05) thu được hợp chất sạch ký hiệu là PS09 (5 mg). Từ phân đoạn W1C2B (85 mg) cho qua cột silica gel pha thường giải hấp với hệ dung môi
CHCl3/MeOH/H2O (9/1/0,03) thu được hợp chất sạch ký hiệu là PS02 (5 mg), hợp chất PS05 (7mg) được tách từ phân đoạn W1C2C (120 mg) với hệ dung môi rửa giải là CHCl3/MeOH/H2O (9/1/0,03). Hai hợp chất PS23, PS10 cũng được tách từ hai phân đoạn W1C2D (95 mg) và W1C2F (90 mg) với hệ dung môi rửa giải là CH2Cl2-MeOH (10/1).
Từ phân đoạn W1D (1,2 g), dùng cột silica gel pha đảo với hệ dung môi giải hấp là MeOH- H2O (1/4) thu được 2 phân đoạn W1D1-W1D2, phân đoạn W1D1 (480 mg) qua cột Sephadex LH-20 với hệ MeOH-H2O (1/3) thu được W1D1A, W1D1B, W1D1C. Từ phân đoạn W1D1B tiếp tục qua cột silica gel pha thường với hệ dung môi giải hấp là CH2Cl2-MeOH (10/1) thu được hợp chất PS20 (4 mg).
Phân đoạn W2 được phân tách tiếp thành 08 phân đoạn nhỏ ký hiệu là W2A- W2H bằng sắc ký cột silica gel pha thường sử dụng dung môi rửa giải tăng dần nồng độ MeOH trong diclorometan (1/20-1/0). Tinh chế phân đoạn W2C (1g) bằng sắc ký cột silica gel pha thường kết hợp với sắc ký rây phân tử sử dụng sephadex LH-20 thu được hợp chất sạch ký hiệu là PS18 (3 mg). Tương tự, phân đoạn W2D (1,8 g) cho qua cột silica gel pha đảo với hệ dung môi giải hấp là MeOH- H2O (1/3) thu được 8 phân đoạn từ W2D1-W2D8, phân đoạn W2D3 (120mg) cho qua cột silica gel pha thường giải hấp với hệ dung môi CH2Cl2-MeOH (7/1) thu được hợp chất sạch ký hiệu là PS13 (6 mg), tương tự hợp chất PS21 (2 mg) được tinh chế từ phân đoạn W2D4 bằng sắc ký cột silica gel pha thường giải hấp với hệ dung môi CH2Cl2-MeOH (7/1) và hợp chất PS25 (3 mg) được tinh chế từ phân đoạn W2D5 bằng sắc ký cột silica gel pha thường giải hấp với hệ dung môi ethyl axetat-MeOH (6/1).
Từ phân đoạn W2G (2,5g), sử dụng cột silica gel pha đảo với hệ dung môi giải hấp là MeOH-H2O (1,5/1) thu được 5 phân đoạn từ W2G1-W2G5, phân đoạn W2G3 (280mg) cho qua cột silica gel pha thường giải hấp với hệ dung môi CH2Cl2-MeOH-H2O (4/1/0,1) thu được các hợp chất sạch ký hiệu là PS31 (5 mg),
PS32 (4mg), PS28 (3,5mg). Với phân đoạn W2G4 (450mg) dùng sắc ký cột silica gel pha thường giải hấp với hệ dung môi CH2Cl2-MeOH-H2O (3/1/0,1) kết hợp với
sắc ký rây phân tử sử dụng sephadex LH-20 thu được các hợp chất sạch ký hiệu là
PS29 (4,5 mg) và PS 30 (5mg).
3.3.2. Hằng số vật lý và dữ kiện phổ của các hợp chất phân lập được: 3.3.2.1. Hợp chất 01 (PS16): Paramignyol A (Chất mới)