Phản ứng PCR với primer RM10825

Phản ứng PCR được tiến hành trong thể tích 20 µl gồm: 15,4 µl nước cất, 2 µl PCR Buffer 10X, 0,4 µl dNTPs, 0,2 µl Taq polymerase, 1 µl ADN, 0,5 µl H và 0,5 µl T của con mồi trong máy GeneAmp PCR system 2700.

Phản ứng PCR được thực hiện qua 30 chu kỳ gia nhiệt (Hình 3.1) trên máy PCR như sau: 5 phút ở 940C, 30 chu kỳ gồm 30 giây ở 940C, 30 giây ở 620C, 30 giây ở 720C; 5 phút ở 720C. Sản phẩm được trữ ở 40C.

Hình 2.5 Sơ đồ minh họa chu kỳ phản ứng PCR với primer RM10825 2.2.4 Điện di sản phẩm PCR

- Điện di trên gel agarose: Sản phẩm PCR với việc sử dụng 4 primer (ESP, IFLP, INSP, EAP) và OPC07 được điện di trên gel agarose 1,5% trong dung dịch TAE 1X bằng máy điện di với hiệu điện thế như sau: 30 phút đầu ở hiệu điện thế 42V, 35 phút sau ở hiệu điện thế 60V. Nhuộm gel khoảng 15 phút trong ethidium bromide (1 mg/L), rửa lại với nước rồi đem chụp ảnh gel bằng máy chụp ảnh trên máy chiếu tia UV. Sự hiện diện của các băng được khuếch đại trên gel agarose sẽ đánh giá sự tồn tại của gen thơm và gen kháng rầy trên lúa.

- Điện di trên gel Acrylamide: Sản phẩm PCR với primer RM212 và RM10825 được chạy điện di trên gel arylamide trong dung dịch TBE 0,5% bằng máy ATTA Compact PAGE-twin với thời gian 60 phút ở hiệu điện thế 24V. Nhuộm gel khoảng 15 phút trong ethidium bromide (10 mg/L), rửa lại với nước rồi đem chụp ảnh gel bằng máy chụp ảnh trên máy chiếu tia UV. Sự hiện diện của các băng được khuếch đại trên gel acrylamide sẽ đánh giá sự tồn tại của gen chịu hạn trên lúa. 4,0 5:0 94,0 0:30 94,0 0:30 62,0 0:30 72,0 72,0 Nhiệt độ (0C) Thời gian (phút:giây) 30 chu kỳ 7:0

CHƯƠNG 3

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 KẾT QUẢ LY TRÍCH ADN

Sau khi ly trích, ADN đã được kiểm tra độ tinh sạch bằng cách điện di agarose gel. Vị trí của ADN trong gel được xác định trực tiếp bằng cách nhuộm gel ở nồng độ thấp của thuốc nhuộm ethidium bromide (EB). Các phân tử EB sẽ xen vào giữa các đoạn ADN và cho phép phát hiện chúng dễ dàng trong gel khi chiếu tia tử ngoại. Kết quả điện di agarose gel ADN cho thấy các ADN được ly trích đều tinh sạch. Những mẫu ADN này được sử dụng cho phản ứng PCR.

Hình 3.1 Kết quả điện di kiểm tra ADN bằng gel agarose 1%.

(1: Phkarum Doul, 2: Phkarum Check, 3: Phkarum Chang, 4: Senpidao, 5: Daw Dam, 6: Nàng Thơm Chợ Đào 3, 7: Nàng Thơm Đục, 8: Hoa Lài, 9: Mẽ Hương 2, 10: OM 4218, 11: Jasmine 85, 12: OM 4900, 13: OM 9915, 14: OM 7347, 15: OM 6377).

3.2 NHẬN DIỆN GEN THƠM VỚI 4 PRIMER ESP, IFAP, INSP VÀ EAP

Bralbury et al. (2005) sử dụng phương pháp ASA (Allele Specific

Amplication) thiết kế 4 loại primer chuyên biệt cho lúa thơm ESP (external anti- sense primer), INSP (internal non-fragrant sense prime), IFAP (internal fragrant anti-sense prime) và EAP (external anti-sense primer) giúp phân biệt kiểu gen của các giống lúa đồng hợp tử thơm (cho băng 580 bp và 257 bp), dị hợp tử thơm (cho băng 580 bp, 355 bp và 257 bp) và giống không thơm (cho băng 580bp và 355 bp).

Kết quả quan sát trên phổ điện di Hình 3.2 cho thấy sản phẩm PCR của các giống lúa cho ra các băng đều rõ nét. Các giống Phkarum Doul, Phkarum Check, Phkarum Chang, Senpidao, Daw Dam, Nàng Thơm Đục, Hoa Lài, Mẽ Hương 2, Jasmine 85, OM 4900, OM 9915, OM 7347, OM 6377 sản phẩm điện di xuất hiện băng 580 bp và 257 bp là các giống có mang gen thơm. Với 2 giống Nàng Thơm

Chợ Đào 3 và OM 4218 thì sản phẩm điện di ADN xuất hiện băng 580 bp và 355 bp không mang gen thơm.

Trong khảo sát này thì giống Nàng Thơm Chợ Đào 3 không mang gen thơm nguyên nhân có thể là do trong quá trình thu mẫu giống đã bị lẫn tạp. Kết quả nghiên cứu này không phù hợp với kết quả nghiên cứu của Hien ctv. (2006), trong nghiên cứu của Hien ctv. (2006) đã sử dụng KOH 1,7% để khảo sát 70 giống lúa có nguồn gốc từ các nước ở châu Á và đã cho kết quả thơm ở giống Nàng thơm Chợ Đào 3.

Bốn primer này ngày càng được sử dụng phổ biến trên thế giới trong việc nhận diện gen thơm trên lúa. Thời gian gần đây, ở Sri Lanka nhóm nhà khoa học đã nhận diện thành công 56 giống/dòng lúa thơm bằng 4 primer này (Kottearachchi et

al., 2010).

Hình 3.2 Sản phẩm PCR các giống lúa với 4 con mồi ESP, INSP, IFAP, EAP

(M: ladder 1kb, 1: Phkarum Doul, 2: Phkarum Check, 3: Phkarum Chang, 4: Senpidao, 5: Daw Dam, 6: Nàng Thơm Chợ Đào 3, 7: Nàng Thơm Đục, 8: Hoa Lài, 9: Mẽ Hương 2, 10: OM 4218, 11: Jasmine 85, 12: OM 4900, 13: OM 9915, 14: OM 7347, 15: OM 6377).

3.3 NHẬN DIỆN GEN KHÁNG RẦY VỚI PRIMER OPC07

Venkateswarlu và ctv. (2012) đã sử dụng primer OPC07 và primer OPAG14 để khảo sát các cá thể trong quần thể F2 IR50/Ptb33 kết quả cho thấy cả hai primer này điều có hiệu quả trong việc xác định gen kháng rầy nâu. Khi phân tích quần thể trồng dồn phân ly với primer OPC07 thì các cá thể nhiễm rầy cho ra sản phẩn điện di ở vị trí 846 bp và các cá thể kháng rầy sản phẩm điện di ở vị trí 697 bp.

Kết quả quan sát trên phổ điện di Hình 3.3 cho thấy có 6 giống: Senpidao, OM 4218, OM 4900, OM 9915, OM 7347 và OM 6377 xuất hiện băng ở vị trí 697 bp có mang gen kháng rầy nâu. Những giống lúa có sự hiện diện của băng 846 bp: Phkarum Doul, Phkarum Chang, Daw Dam, Nàng Thơm Chợ Đào 3, Nàng Thơm Đục, Hoa Lài và Jasmine 85 là những giống không mang gen kháng. Còn 2 giống Phkarum Check, Mẽ Hương 2 không có sự hiện diện của các băng, primer OPC07

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 580 bp 257 bp 400 bp 200 bp 600 bp 355 bp + + + + + - + + + - + + + + +

không thể bắt cặp với gen của 2 giống lúa này. Có thể nguyên nhân là do thao tác không lấy được ADN trong tube, nhiệt độ bắt cặp chưa phù hợp…

Ứng dụng chỉ thị phân tử này để xác định sự có mặt của các gen kháng rầy nâu đã giúp cho các nhà chọn tạo giống nhận diện chính xác các gen kháng rầy nâu nhằm giúp rút ngắn thời gian trong công tác chọn tạo giống.

Hình 3.3 Phổ điện di sản phẩm PCR của 15 giống lúa sử dụng primer OPC07

3.4 NHẬN DIỆN GEN CHỊU HẠN VỚI PRIMER RM212

Kanagaraj et al. (2010) đã khảo sát 1206 primer để tìm ra các primer có liên kết với gen chịu hạn, kết quả cho thấy có 134 primer liên quan đến gen chịu hạn trong đó 3 primer là RM212, RM302, RM3825 có liên kết chặt với gen chịu hạn và đã được sử dụng trong chương trình chọn giống lúa hạn bằng dấu phân tử. Zhu et

al. (2013) nếu các giống lúa được nhận diện bằng cặp mồi RM212 và xuất hiện

băng ở vị trí 136 bp thì có khả năng mang gen chịu hạn, còn xuất hiện băng ở vị trí 154 bp không mang gen chịu hạn.

Kết quả quan sát trên phổ điện di Hình 3.4 cho thấy chỉ có giống OM 7347 là không có mang gen chịu hạn có xuất hiện băng ở vị trí 154 bp, các giống Phkarum Doul, Phkarum Check, Phkarum Chang, Senpidao, Daw Dam, Nàng Thơm Chợ Đào 3, Nàng Thơm Đục, Hoa Lài, Mẽ Hương 2, OM 4218, Jasmine 85, OM 4900, OM 9915, OM 6377 đều mang gen chịu hạn đều xuất hiện băng ở vị trí 136 bp cùng vị trí với giống đối chứng VND 9520. Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của McCouch et al., (2002), ông cũng cho rằng các giống lúa chịu hạn có thể được nhận diện bằng cặp mồi RM212 với sự xuất hiện của băng ADN ở vị trí 136 bp.

Nitika Sandhu et al., (2011) đã sử dụng 3 primer RM212, RM302, RM3825 để khảo sát khả năng liên kết của các primer này với gen chịu hạn của một số giống lúa ở Ấn Độ kết quả cho thấy primer RM302 và RM212 có liên kết chặt với gen

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 500 bp 1000 bp 697 bp 846 bp - 0 - + - - - - 0 + - + + + + - 0 - + - - - - 0 + - + + + +

chịu hạn. Primer RM212 ngày càng tỏ ra hiệu quả trong việc khảo sát các giống lúa chịu hạn trên thế giới.

Nguyễn Thanh Thảo (2013) cũng đã sử dụng primer RM212 và RM302 kết hợp với việc thử hạn nhân tạo trong dung dịch muối KClO3 để khảo sát tính chịu hạn của 12 giống lúa ở Việt Nam. Kết quả cho thấy cả hai primer đều có hiệu quả trong việc nhận diện các giống lúa có khả năng chịu hạn.

Hình 3.4 Phổ điện di sản phẩm PCR của 15 giống lúa và 1 đối chứng bằng cặp mồi RM212

3.5 NHẬN DIỆN GEN KHÁNG MẶN VỚI PRIMER RM10825

Michael J (2010) đã lập bản đồ gen và tìm kiếm những primer hỗ trợ trong việc nâng cao khả năng kháng mặn trên lúa. Kết quả cho thấy có 21 primer liên quan đến gen kháng mặn, trong đó primer RM10825 liên kết chặt với gen kháng mặn. Khi sử dụng primer RM10825 các giống xuất hiện băng ở vị trí 137 bp cùng vị trí với Pokkali có khả năng mang gen chịu mặn. Những giống xuất hiện băng ở vị trí 181 bp đồng vị trí với IR28 mang gen nhiễm mặn.

Kết quả phân tích phổ điện di sản phẩm Hình 3.5 cho thấy 5 giống lúa Senpidao, Daw Dam, OM 4900, OM 9915 và OM 6377 có băng ADN xuất hiện ở vị trí 137 bp các giống này có khả năng mang gen chịu mặn (tương tự giống chuẩn kháng Pokkali). Với 8 giống lúa Phkarum, Phkarum Check, Phkarum Chang, Hoa Lài, Mẽ Hương, OM 4218, Jasmine 85 và OM 7347 xuất hiện băng ở vị trí 181 bp mang gen nhiễm mặn (tương tự ví trí giống chuẩn nhiễm IR28). Còn 2 giống Nàng Thơm Chợ Đào 3 và Nàng Thơm Đục xuất hiện vị trí băng 164 bp không quyết định tính kháng mặn cũng như tính nhiễm của các giống, điều này chỉ phụ thuộc vào việc xuất hiện các band ADN ở vị trí 137 bp và 181 bp.

Nguyễn Thành Duy Tân (2014) cũng đã sử dụng 3 primer RM336,

RM10825, RM10793 và kết hợp với việc thử khả năng chịu mặn trong điều kiện nhân tạo để đánh giá khả năng chịu mặn của 12 giống lúa địa phương ở tỉnh Trà

200 bp

100 bp 136 bp

M 1 2 3 4 5 6 7 8 16 M 9 10 11 12 13 14 15 16

+ + + + + + + + + + + + + + - + +

Vinh. Kết quả cho thấy cả 3 primer này có thể sử dụng trong việc nhận diện các giống lúa chịu mặn, rút ngắn được thời gian đánh giá.

Hình 3.5 Phổ điện di sản phẩm PCR của 15 giống lúa và 2 đối chứng bằng cặp mồi RM10825

3.6 KẾT QUẢ NHẬN DIỆN DẤU PHÂN TỬ ĐỐI VỚI CÁC TÍNH TRẠNG THƠM, KHÁNG RẦY, CHỊU HẠN VÀ CHỊU MẶN THƠM, KHÁNG RẦY, CHỊU HẠN VÀ CHỊU MẶN

Qua kết quả tổng hợp trong Bảng 3.1 cho thấy 4 giống Senpidao, OM 4900, OM 9915, OM 6377 đều có khả năng mang đầy đủ 4 gen chịu hạn, kháng mặn, kháng rầy và gen thơm.

Trong các giống còn lại thì có 7 giống Phkarum Doul, Phkarum Check, Phkarum Chang, Nàng Thơm Đục, Hoa Lài, Mẽ Hương 2, Jasmine 85 có khả năng mang gen thơm, chịu hạn và không mang gen kháng rầy, kháng mặn. Giống Daw Dam có khả năng mang gen thơm, chịu hạn, kháng mặn và không mang gen kháng rầy. Giống OM 4218 có khả năng mang gen kháng rầy, chịu hạn và không mang gen thơm, gen kháng mặn. Với giống OM 7347 có khả năng mang gen thơm, kháng rầy và không mang gen chịu hạn, kháng mặn. Còn giống Nàng Thơm Chợ Đào 3 chỉ mang gen chịu hạn, không mang gen thơm, kháng rầy và kháng mặn.

M 16 17 1 2 3 4 5 6 7 M 16 17 8 9 10 11 12 13 14 15 200 bp 100 bp 137 bp 181 bp + - - - - + + - - + - - - - - + + - + 164 bp

Bảng 3.1 Tổng hợp kết quả phân tích phổ điện di với các tính trạng thơm, kháng rầy, chịu hạn, chịu mặn

STT Tên giống Thơm Kháng rầy Chịu hạn Kháng mặn

1 Phkarum Doul + - + - 2 Phkarum Check + 0 + - 3 Phkarum Chang + - + - 4 Senpidao + + + + 5 Daw Dam + - + + 6 Nàng Thơm Chợ Đào 3 - - + - 7 Nàng Thơm Đục + - + - 8 Hoa Lài + - + - 9 Mẽ Hương 2 + 0 + - 10 OM 4218 - + + - 11 Jasmine 85 + - + - 12 OM 4900 + + + + 13 OM 9915 + + + + 14 OM 7347 + + - - 15 OM 6377 + + + +

CHƯƠNG 4

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1 KẾT LUẬN

Thí nghiệm khảo sát sự hiện diện của gen thơm, kháng rầy, chịu hạn và chịu mặn của 15 giống lúa bằng chỉ thị phân tử ADN cho thấy rằng:

- Khi sử dụng primer ESP, IFAP, INSP và EAP đã nhận diện được 13 giống lúa mang gen thơm Phkarum Doul, Phkarum Check, Phkarum Chang, Senpidao, Daw Dam, Nàng Thơm Đục, Hoa Lài, Mẽ Hương 2, Jasmine 85, OM 4900, OM 9915, OM 7347, OM 6377.

- Với primer OPC07 đã nhận diện được 6 giống lúa mang gen kháng rầy Senpidao, OM 4218, OM 4900, OM 9915, OM 7347, OM 6377 trong tổng số 15 giống. Các giống lúa này có thể được sử dụng làm nguồn vật liệu trong khai thác và phát triển nguồn gen lúa kháng rầy ở Việt Nam.

- Sử dụng primer RM212 đã nhận diện được 14 giống lúa mang gen chịu hạn Phkarum Doul, Phkarum Check, Phkarum Chang, Senpidao, Daw Dam, Nàng Thơm Chợ Đào 3, Nàng Thơm Đục, Hoa Lài, Mẽ Hương 2, OM 4218, Jasmine 85, OM 4900, OM 9915, OM 6377 trong tổng số 15 giống.

- Sử dụng primer RM10825 đã nhận diện được 5 giống lúa mang gen kháng mặn Senpidao, Daw Dam, OM 6377, OM 4900, OM 9915 trong tổng số 15 giống.

4.2 ĐỀ NGHỊ

- Sử dụng các chỉ thị phân tử chuyên biệt để phục vụ cho công tác chọn giống, rút ngắn được thời gian và hiệu quả nhất.

- Các giống lúa này cần khảo sát thêm ở điều kiện ngoài đồng kết hợp với sự so sánh, đánh giá giữa việc sử dụng dấu phân tử so với điều kiện thực tế để có kết luận chính xác hơn.

- Các giống đã được đánh giá, phân loại có kết quả tốt cần được đưa vào chương trình chọn giống với mục tiêu cụ thể.

- Tiếp tục khảo nghiệm thêm nhiều giống nhằm đa dạng nguồn giống phục vụ cho công tác chọn tạo sao này.

TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT:

Bùi Huy Đáp, (1978). Lúa Việt Nam trong vùng lúa nam và đông nam Châu Á.

NXB Nông Nghiệp TP.HCM.

Bùi Huy Đáp, (1999). Một số vần đề về cây lúa. NXB Nông Nghiệp Hà Nội.

Đỗ Khắc Thịnh, (2003). Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố canh tác và yếu

tố môi trường đối với năng suất và phẩm chất lúa thơm ở Đồng Bằng Sông Cửu Long. Luận Án Tiến Sĩ Nông Nghiệp, Đại Học Nông Lâm, TP.HCM,

Việt Nam.

Lê Doãn Biên và ctv, (1997). Nghiên cứu chất lượng lúa gạo ở Việt Nam. Kết quả nghiên cứu Khoa học Công nghệ Nông nghiệp (1994-1995). NXB Nông Nghiệp Hà Nội.

Lương Minh Châu, Lương Thị Phương và Bùi Chí Bửu (2006). Đánh giá tính kháng của các tổ hợp lúa năng suất cao, phẩm chất tốt với quần thể rầy nâu tại Đồng Bằng Sông Cửu Long 2003-2005. Tạp chí Nông nghiệp và phát

Đặc điểm hình thái và sinh học

SƠ LƯỢC VỀ LÚA CHỊU MẶN