SƠ LƯỢC VỀ LÚA CHỊU MẶN

1.6.1 Cơ chế chống chịu mặn của cây lúa

Yeo và Flower (1984), đã tổng kết cơ chế chống chịu mặn như sau:

- Hiện tượng ngăn chặn muối: Cây không hấp thu một lượng muối dư thừa nhờ hiện tượng hấp thu có chọn lọc.

- Hiện tượng tái hấp thu: Cây hấp thu một lượng muối thừa nhưng được tái hấp thu trong mô libe. Na+ không chuyển vị đến chồi thân.

- Chuyển vị từ rễ đến chồi: Tính trạng chống chịu mặn được phối hợp với một mức độ cao về điện phân ở rễ lúa, và mức độ thấp về điện phân ở chồi, làm cho sự chuyển vị Na+ trở nên ít hơn từ rễ đến chồi.

- Hiện tượng ngăn cách từ lá đến lá: Lượng muối dư thừa được chuyển từ lá non sang lá già, muối được định vị tại lá già không có chức năng, không thể chuyển ngược lại.

- Chống chịu ở mô: Cây hấp thu muối và được ngăn cách trong các không bào của lá, làm giảm ảnh hưởng độc hại của muối đối với hoạt động sinh trưởng của cây.

- Ảnh hưởng pha loãng: Cây hấp thu muối nhưng sẽ làm loãng nồng độ muối nhờ tăng cường tốc độ phát triển nhanh và gia tăng hàm lượng nước trong chồi.

1.6.2 Ảnh hưởng bất lợi của mặn đối với cây lúa

Cây lúa trồng ở đất mặn phải đối mặt với stress thẩm thấu cao, nồng độ cao của các ion độc tố như Na+ và Cl- mà cuối cùng gây ra sự giảm sinh trưởng. Có hai loại đất mặn được hình thành do Cl- và SO4-, nhưng NaCl thì độc nhất. Sự gia tăng nồng độ muối gây ra việc giảm đối với trọng lượng khô của cây, hấp thu dưỡng

chất, và năng suất hạt lúa. Cả hai loại mặn đều ức chế sự sinh trưởng và năng suất lúa.

Mặn gây ra những triệu chứng chính cho cây lúa như: đầu lá trắng theo sau bởi sự cháy chóp lá, màu nâu của lá và chết lá, sinh trưởng của cây bị ức chế, số chồi thấp, sinh trưởng của rễ kém, lá cuộn lại, tăng số hạt bất thụ, số hạt trên bông thấp, giảm trọng lượng 1000 hạt, thay đổi khoảng thời gian trổ, chỉ số thu hoạch thấp, năng suất hạt thấp.

Một số giống lúa truyền thống thích nghi tốt với điều kiện đất nhiễm mặn hơn so với các giống lúa hiện đại. Bao gồm các giống: Đốc Đỏ, Đốc Phụng, Nàng Keo, Tài Nguyên, Tép Hạnh, Một Bụi Đỏ...Trong sự tiến bộ của ngành chọn giống lúa, đã chọn được một số giống lúa vừa kiểu gen ngắn ngày vừa chịu đựng được điều kiện mặn như: MTL 119, OM 1314, OM 1490, OM 2031...

1.6.3 Ứng dụng công nghệ sinh học trong chọn giống lúa mặn

Viện lúa đồng bằng sông Cửu Long đã chọn tạo dược nhiều giống lúa ngắn ngày cá khả năng chịu mặn như: giống OM 5451, OM 2517-KG, OM 6162, OM 5464... có khả năng chịu mặn khá có thể canh tác trong điều kiện đất mặn khoảng 5‰. Kết quả phân tích QTL các tính trạng có liên quan trên cơ sở đánh giá kiểu hình trong điều kiện đất mặn thì các giống lúa AS 996, OM 2395, OM 1490, OM 1348-9, OM 1352-5, OM 3240.

Lang NT và ctv. (2001), dùng marker phân tử xác định gen chống chịu mặn của cây lúa ở giai đoạn sinh dưỡng và sinh sản. Giống lúa Đốc Phụng (Việt Nam) được xem là giống chịu mặn cao lai với giống cải tiến, giống nhiễm mặn IR28. Trong số 41 maker phân tử kiểm tra trên các cặp cha mẹ, 10 maker biểu hiện sự đa dạng trong sự khuếch đại maker bằng sự tác động qua lại của chuổi polymerase. Những primer cho sự đa dạng là: RM202, RM223, RM231, RM235, RM237, RM214, RM218, RM201, RM232 và RM206. Trong nhóm trên chỉ có RM223 liên kết với tính chống chịu mặn ở giai đoạn cây con. Tất cả những đoạn ADN trong nhân tế bào ở các cá thể F3 được kiểm tra bằng primer RM223. Kết quả chỉ ra chính xác sự dò tìm cây trồng kháng ở giai đoạn sinh dưỡng và sinh sản với tỷ lệ mong đợi 82-92%.

Mohammadi-Nejad và ctv. (2008), đã khuyến cáo sử dụng hai marker

RM8094 trong xác định kiểu gen của cây lúa chống chịu mặn có mang đoạn QTL Saltol trong các chương trình lai tạo giống lúa chịu mặn.

Theo Michael J (2010) cho rằng khi sử dụng primer RM10825 các giống có xuất hiện băng ở vị trí 137 bp cùng vị trí với Pokkali có khả năng mang gen chịu mặn. Những giống xuất hiện băng ở vị trí 181 bp cùng vị trí với IR28 mang gen nhiễm mặn.

CHƯƠNG 2

PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 PHƯƠNG TIỆN

2.1.1 Thời gian và địa điểm

- Thời gian: Từ tháng 5/2013 đến tháng 12/2013.

- Địa điểm: phòng thí nghiệm Di truyền Thực vật, Bộ môn Di Truyền Giống Nông nghiệp, Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng, Trường Đại Học Cần Thơ.

2.1.2 Giống

Thí nghiệm bao gồm 15 giống lúa có nguồn gốc từ Việt Nam, Campuchia, Thái Lan (Bảng 2.1).

Bảng 2.1 Danh sách 15 giống lúa thí nghiệm

STT Tên giống Nguồn gốc

1 Phkarum Doul Campuchia

2 Phkarum Check Campuchia

3 Phkarum Chang Campuchia

4 Senpidao Campuchia

5 Daw Dam Thái Lan

6 Nàng Thơm Chợ Đào 3 Việt Nam

7 Nàng Thơm Đục Việt Nam

8 Hoa Lài Việt Nam

9 Mẽ Hương 2 Việt Nam

10 OM 4218 Việt Nam

11 Jasmine 85 Thái Lan

12 OM 4900 Việt Nam 13 OM 9915 Việt Nam 14 OM 7347 Việt Nam 15 OM 6377 Việt Nam 2.1.3Thiết bị, dụng cụ và hóa chất sử dụng 2.1.3.1 Thiết bị và dụng cụ

- Cân điện tử Adventure của OHAUS (Mỹ)

- Water and Oilbaths WB/ob 7-45 WBU 45 của Memmert (Đức) - Máy vortex của Taitec (Nhật)

- Máy ly tâm Mini CENTRIFUGE MCF-1350 của Jircas (Nhật) - Máy khuấy Advantec SR500t

- Máy điện di protein ATTA CompactPAGE-twin của Jircas (Nhật)

- Máy PCR GeneAmp PCR system 2700 (Amplied Biosystems-Malaysia) - Bộ điện di ATTO CORPORATION AE-7344 (Nhật)

- Máy đọc gel bằng tia UV của BioBlock Scientific (Pháp) - Máy ảnh Canon (Nhật)

- Một số dụng cụ khác: beaker 25 ml, beaker 100 ml, tube 1,5 ml, típ 1 ml,...

2.1.3.2 Hóa chất

- Hóa chất ly trích ADN: CTAB buffer, Mercaptoethanol, chloroform...

- Hóa chất cho PCR và điện di: PCR buffer, MgCl2, dNTPs, Primer, nước cất, agarose tinh khiết, ethidium bromide... Dung dịch điện di: TAE (1X).

- Dung dịch điện di: Glycine, Tris, SDS…

- Hóa chất nhuộm gel: Coomassive Brilliant Blue R250, Methanol,…

2.1.3.3 Primer

Bảng 2.2 Trình tự các con mồi được dùng trong thí nghiệm

STT Đặc tính

nhận diện Tên con mồi Trình tự (5’- 3’)

1 External sense Primer

(ESP) TTGTTTGGAGCTTGCTGATG 2 Internal Fragrant Antisense Primer (IFAP) CATAGGAGCAGCTGAAATATATACC 3 Internal Non-Fragrant

sense Primer (INSP) CTGGTAAAAAGATTATGGCTTCA

Tính thơm

External Antisense

Primer (EAP) AGTGCTTTACAAAGTCCCGC

5 Kháng rầy

nâu OPC07 GTCCCGACGA

Forward CCACTTTCAGCTACTACCAG 6 Chịu hạn RM212 Reverse CACCCATTTGTCTCTCATTATG Forward GGACACAAGTCCATGATCCTATCC 7 Kháng mặn RM10825 Reverse CTTTCCTTTCCATCCTTGTTGC

2.2 PHƯƠNG PHÁP 2.2.1 Ly trích ADN

ADN từ lá của 15 giống lúa được ly trích và tinh sạch bằng phương pháp ly trích CTAB rút gọn (Taylor và Powell, 1982).

Quy trình ly trích bao gồm các bước như sau:

- Cân khoảng 100 mg mẫu, sau đó nghiền mịn mẫu với CTAB (2x) 1000 μl. Rồi cho vào ống tuýp 1,5 ml.

- Thêm 10 μl ME, trộn đều đem đi ủ trong vòng 1 giờ.

- Lấy mẫu ra thêm 500 μl phenol : chloroform : isoamyl với tỷ lệ 25 : 24 : 1 trộn đều đem ly tâm 8000 vòng/ 5 phút.

- Đem ra rút lấy 750 μl phần dung dịch trong bên trên cho vào tuýp mới. Thêm 500 μl PCIA trộn đều đem đi ly tâm 13000 vòng/ 10 phút.

- Đem ra rút lấy 550 μl dung dịch trong bên trên cho vào tuýp mới.

- Thêm 5 μl RNAse, trộn đều và ủ 370C/ 1 giờ.

- Thêm 500 μl Chloroform, trộn đều ly tâm 13000 vòng/ 10 phút.

- Rút lấy 450 μl phần dung dịch bên trên cho vào tuýp mới. Thêm 400 μl Chloroform. Ly tâm 13000 vòng/ 10 phút.

- Rút lấy 300 μl phần dung dịch bên trên cho vào tuýp mới. Thêm 300 μl isopropanol trộn đều ủ trong tủ lạnh 15 phút, đem ra ly tâm 13000 vòng/ 10 phút.

- Đổ bỏ nước chừa lại phần kết tủa. Thêm 500 μl Ethanol 70% lạnh, lắc nhẹ. Đem ly tâm 13000 vòng/ 5 phút. (Làm 2 lần)

- Đổ bỏ nước chừa phần kết tủa. Thêm 500 μl Ethanol 100% lắc nhẹ, đem ly tâm 13000 vòng/ 5 phút.

- Đổ bỏ nước, chừa lại phần kết tủa, để khô tự nhiên.

- Thêm 30 μl TE (8.0). Hòa tan kết tủa và đem trữ mẫu ở nhiệt độ -200C.

2.2.2 Kiểm tra ADN bằng phương pháp điện di agarose

ADN sau khi được ly trích và tinh sạch sẽ được kiểm tra bằng cách điện di trên gel agarose 1% (w/v). Cân 0,3 g agarose và đong 30 ml dung dich TAE 1X cho vào bình tam giác 100 ml, đậy kín bình tam giác lại bằng màng bao thực phẩm, lắc trộn đều rồi cho vào lò vi sóng đun sôi khoảng 1 phút.

Trong quá trình nấu, sau 30 giây thì tạm dừng nấu, lấy ra lắc trộn nhẹ để agarose tan đều trong TAE. Sau khi nấu xong, để nguội khoảng 50oC thì đổ vào bộ khuôn điện di.

Khi agarose đã đặc lại (khoảng 10 phút), nhẹ nhàng lấy ra và cho vào bộ điện di, cho TAE 1X vào bộ điện di sao cho lượng dung dịch điện di đủ ngập gel. Bước

tiếp theo, trộn đều mỗi mẫu gồm 1 ml loading dye 6X, 1 ml ADN và 4 ml nước cất trên giấy parafilm rồi cẩn thận bơm từng mẫu vào giếng trên gel tương ứng.

Mẫu được điện di khoảng 45 phút ở hiệu điện thế 60V. Nhuộm khoảng 10 phút trong dung dịch ethidium bromide (10 mg/ml), rửa lại với nước rồi đem chụp ảnh gel bằng máy chụp gel.

2.2.3 Phản ứng PCR

2.2.3.1 Phản ứng PCR với 4 primer ESP, IFLP, INSP, EAP

Phản ứng PCR được tiến hành trong thể tích 20 µl gồm: 14,4 µl nước cất, 2 µl PCR Buffer 10X, 0.4 µl dNTPs, 0,2 µl Taq polymerase, 1 µl ADN và 2 µl primer (0,5 µl External sense Primer, 0,5 µl Internal Fragrant Antisense Primer, 0,5 µl Internal Non-Fragrant sense Primer, 0,5 µl External Antisense Primer) trong máy GeneAmp PCR system 2700.

Hình 2.1: Vị trí tương đối của đoạn mồi ESP, IFAP, INSP, EAP được sử dụng trong phản ứng PCR.

Phản ứng PCR được thực hiện qua 30 chu kỳ gia nhiệt trên máy PCR như sau: 2 phút ở 940C, 30 chu kỳ gồm 30 giây ở 940C, 30 giây ở 580C, 30 giây ở 720C; 5 phút ở 720C. Sản phẩm được trữ ở 40C.

Hình 2.2 Sơ đồ minh họa chu kỳ phản ứng PCR với primer ESP, IFAP, INSP, EAP

580 bp 355 bp 257 bp INSP IFA 2:00 94,0 0:30 5:00 94,0 58,0 0:30 72,0 72,0 4,0 0:30 30 chu kỳ Nhiệt độ (0C) Thời gian (phút:giây)

2.2.3.2 Phản ứng PCR với primer OPC07

Phản ứng PCR được tiến hành trong thể tích 15 µl gồm: 11,6 µl nước cất, 1,5 µl PCR Buffer 10X, 0,4 µl dNTPs, 0,15 µl Taq polymerase, 1 µl ADN, 0,4 µl OPC07 primer của con mồi trong máy GeneAmp PCR system 2700.

Phản ứng PCR được thực hiện qua 30 chu kỳ gia nhiệt trên máy PCR như sau: 5 phút ở 950C, 30 chu kỳ gồm 30 giây ở 940C, 30 giây ở 400C, 30 giây ở 720C; 5 phút ở 720C. Sản phẩm được trữ ở 40C.

Hình 2.3 Sơ đồ minh họa chu kỳ phản ứng PCR với primer OPC07

2.2.3.3 Phản ứng PCR với primer RM212

Phản ứng PCR được tiến hành trong thể tích 20 µl gồm: 15,4 µl nước cất, 2 µl PCR Buffer 10X, 0,4 µl dNTPs, 0,2 µl Taq polymerase, 1 µl ADN, 0,5 µl H và 0,5 µl T của con mồi trong máy GeneAmp PCR system 2700.

Phản ứng PCR được thực hiện qua 30 chu kỳ gia nhiệt (Hình 3.1) trên máy PCR như sau: 5 phút ở 940C, 30 chu kỳ gồm 30 giây ở 940C, 30 giây ở 570C, 30 giây ở 720C; 5 phút ở 720C. Sản phẩm được trữ ở 40C.

Hình 2.4 Sơ đồ minh họa chu kỳ phản ứng PCR với primer RM212

0:30 5:0 72,0 72,0 4,0 60,0 0:30 30 chu kỳ 5:0 94,0 94,0 0:30 Nhiệt độ (0C) Thời gian (phút:giây) Nhiệt độ (0C) Thời gian (phút:giây) 5:00 95,0 95,0 0:30 40,0 0:30 30 chu kỳ 0:30 5:00 72,0 72,0 4,0

2.2.3.4 Phản ứng PCR với primer RM10825

Phản ứng PCR được thực hiện qua 30 chu kỳ gia nhiệt (Hình 3.1) trên máy PCR như sau: 5 phút ở 940C, 30 chu kỳ gồm 30 giây ở 940C, 30 giây ở 620C, 30 giây ở 720C; 5 phút ở 720C. Sản phẩm được trữ ở 40C.

Hình 2.5 Sơ đồ minh họa chu kỳ phản ứng PCR với primer RM10825 2.2.4 Điện di sản phẩm PCR

- Điện di trên gel agarose: Sản phẩm PCR với việc sử dụng 4 primer (ESP, IFLP, INSP, EAP) và OPC07 được điện di trên gel agarose 1,5% trong dung dịch TAE 1X bằng máy điện di với hiệu điện thế như sau: 30 phút đầu ở hiệu điện thế 42V, 35 phút sau ở hiệu điện thế 60V. Nhuộm gel khoảng 15 phút trong ethidium bromide (1 mg/L), rửa lại với nước rồi đem chụp ảnh gel bằng máy chụp ảnh trên máy chiếu tia UV. Sự hiện diện của các băng được khuếch đại trên gel agarose sẽ đánh giá sự tồn tại của gen thơm và gen kháng rầy trên lúa.

- Điện di trên gel Acrylamide: Sản phẩm PCR với primer RM212 và RM10825 được chạy điện di trên gel arylamide trong dung dịch TBE 0,5% bằng máy ATTA Compact PAGE-twin với thời gian 60 phút ở hiệu điện thế 24V. Nhuộm gel khoảng 15 phút trong ethidium bromide (10 mg/L), rửa lại với nước rồi đem chụp ảnh gel bằng máy chụp ảnh trên máy chiếu tia UV. Sự hiện diện của các băng được khuếch đại trên gel acrylamide sẽ đánh giá sự tồn tại của gen chịu hạn trên lúa. 4,0 5:0 94,0 0:30 94,0 0:30 62,0 0:30 72,0 72,0 Nhiệt độ (0C) Thời gian (phút:giây) 30 chu kỳ 7:0

CHƯƠNG 3

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 KẾT QUẢ LY TRÍCH ADN

Sau khi ly trích, ADN đã được kiểm tra độ tinh sạch bằng cách điện di agarose gel. Vị trí của ADN trong gel được xác định trực tiếp bằng cách nhuộm gel ở nồng độ thấp của thuốc nhuộm ethidium bromide (EB). Các phân tử EB sẽ xen vào giữa các đoạn ADN và cho phép phát hiện chúng dễ dàng trong gel khi chiếu tia tử ngoại. Kết quả điện di agarose gel ADN cho thấy các ADN được ly trích đều tinh sạch. Những mẫu ADN này được sử dụng cho phản ứng PCR.

Hình 3.1 Kết quả điện di kiểm tra ADN bằng gel agarose 1%.

(1: Phkarum Doul, 2: Phkarum Check, 3: Phkarum Chang, 4: Senpidao, 5: Daw Dam, 6: Nàng Thơm Chợ Đào 3, 7: Nàng Thơm Đục, 8: Hoa Lài, 9: Mẽ Hương 2, 10: OM 4218, 11: Jasmine 85, 12: OM 4900, 13: OM 9915, 14: OM 7347, 15: OM 6377).

3.2 NHẬN DIỆN GEN THƠM VỚI 4 PRIMER ESP, IFAP, INSP VÀ EAP

Bralbury et al. (2005) sử dụng phương pháp ASA (Allele Specific

Amplication) thiết kế 4 loại primer chuyên biệt cho lúa thơm ESP (external antisense primer), INSP (internal non-fragrant sense prime), IFAP (internal fragrant anti-sense prime) và EAP (external anti-sense primer) giúp phân biệt kiểu gen của các giống lúa đồng hợp tử thơm (cho băng 580 bp và 257 bp), dị hợp tử thơm (cho băng 580 bp, 355 bp và 257 bp) và giống không thơm (cho băng 580bp và 355 bp).

Kết quả quan sát trên phổ điện di Hình 3.2 cho thấy sản phẩm PCR của các giống lúa cho ra các băng đều rõ nét. Các giống Phkarum Doul, Phkarum Check, Phkarum Chang, Senpidao, Daw Dam, Nàng Thơm Đục, Hoa Lài, Mẽ Hương 2, Jasmine 85, OM 4900, OM 9915, OM 7347, OM 6377 sản phẩm điện di xuất hiện băng 580 bp và 257 bp là các giống có mang gen thơm. Với 2 giống Nàng Thơm

Chợ Đào 3 và OM 4218 thì sản phẩm điện di ADN xuất hiện băng 580 bp và 355 bp không mang gen thơm.

Trong khảo sát này thì giống Nàng Thơm Chợ Đào 3 không mang gen thơm

Đặc điểm hình thái và sinh học

Phản ứng PCR với primer RM10825