1 D.longicornu
1.2.3Môi trường dinh dưỡng trong nuôi cấy in vitro
Môi trường nuôi cấy là ñiều kiện tối cần thiết, là yếu tố quyết ñịnh cho sự phân hóa tế bào và cơ quan trong nuôi cấỵ Có nhiều loại môi trường nuôi cấy cho các loại thực vật và với các mục ñích nuôi cấy khác nhaụ Dựa vào thành phần, hàm lượng chất dinh dưỡng vô cơ có thể phân các môi trường nuôi cấy thành bốn nhóm sau (Trigiano R.N và GrayD.J., 1999) [101] và (Nguyễn Quang Thạch, 2009) [43]:
- Nhóm môi trường giàu dinh dưỡng: ðại diện là môi trường MS (Murashige - Skoogs, 1962). Nhóm môi trường này có hàm lượng muối khoáng cao, nhất là muối nitrat amon, kali, các nguyên tố vi lượng ñầy ñủ. Môi trường thuộc nhóm này thích hợp hầu hết các loại và ñối tượng nuôi cấỵ
- Nhóm môi trường ñủ dinh dưỡng: ñại diện là các môi trường N6, B5, SH. Nhóm này có hàm lượng dinh dưỡng ña lượng và vi lượng thấp hơn môi trường MS nhưng ñặc biệt có hàm lượng natri kali caọ
- Nhóm môi trường nghèo dinh dưỡng: ñại diện cho nhóm này là môi trường Nitsch, Knop, KnudsonC.
- Nhóm môi trường thích hợp ñể nuôi cấy các cây thân gỗ: môi trường WPM, DKW…
Trong các loại môi trường nuôi cấy nêu trên thì việc bổ sung thêm các hỗn hợp chất tự nhiên: là thành phần thường ñược sử dụng nhưng không phải
là bắt buộc trong tất cả các môi trường nuôi cấỵ Chúng làm gia tăng thành phần dinh dưỡng và chất có hoạt tính sinh lý cho môi trường nên kích thích sự sinh trưởng và phân hoá của mẫu câỵ ðiều này ñặc biệt có ý nghĩa ñối với nuôi cấy in vitro các cây dễ bị biến dị dưới tác ñộng của các chất ñiều tiết sinh trưởng tổng hợp như cây lan. Các hỗn hợp chất tự nhiên thường ñược sử dụng bao gồm:
* Nước dừa: thường chứa các axit amin, axit hữu cơ, ñường, ARN, ADN. ðặc biệt trong nước dừa có chứa những hợp chất quan trọng cho nuôi cấy in vitro ñó là: myo inositol, các hợp chất có hoạt tính auxin, các glucosit
của cytokinin. Do vậy, khi bổ sung vào môi trường nuôi cấy nước dừa kích thích sự phân chia, sinh trưởng và phát sinh hình thái của tế bào, mô nuôi cấỵ Nước dừa thường ñược sử dụng rất hiệu quả trong việc thay thế các hợp chất ñiều tiết sinh trưởng tổng hợp nhân tạo khi nuôi cấy hoa lan (Mamoru Kusomoto, 1980) [81].
Nước dừa ñược sử dụng như là một chất truyền thống trong nuôi cấy mô nhân giống cây trồng, trong nước dừa có nhiều các thành phần ñộc ñáo của các loại ñường, vitamins, khoáng chất, axit amin và chất ñiều tiết sinh trưởng. Các loại ñường có trong nước dừa như: saccaroza, glucoza, fructoza, mannitol, sorbitol, myo-inositol, scyllo-inositol…; các vitamins như: C, B1, B2, B3, B5, B6, Folate, Folic axít, Biotin, Niacin…; khoáng chất như: Ca, Fe, Mg, P, K, Na, Zn, Cu, Mn, Se, Cl, S, Al,…; axít amin như: alanin, ß-alanin, arginine, asparagine, glutamine, aspartic acid, cystine, glutamine acid, glycine, homoserine, histidine, isoleucine, lysine, methionine, ornithine, phenylalanine, pipecolic acid, praline, serine, tyrosine, tryptophan, threonine, valine, dihydroxyphenylaline, hydroxyproline, pipecolic acid,…; acid hữu cơ như: tartaric, malic, citric, acetic, pyridoline, succinic, shilinic, quinic acids…; chất ñiều tiết sinh trưởng thuộc nhóm: auxin; 1,3- diphenylurea;
cytokinin. Nhóm auxin có trong nước dừa chủ yếu là indole-3-acetic acid chiếm 150.6 nM; nhóm cytokinin có: N6-isopentenyladenine chiếm 0.26 nM, dihydrozeatin chiếm 0.14 nM, trans-zeatin chiếm 0.09nM , kinetin chiếm 0.31 nM, ortho-topolin chiếm 3.29nM , dihydrozeatin O – glucoside chiếm 46.6nM, trans-zeatin O – glucoside chiếm 48.7nM , trans-zeatin riboside chiếm 76.2nM, kinetin riboside chiếm 0.33nM, trans-zeatin riboside-5- monophosphate chiếm 10.2nM; nhóm gibberellin có gibberellin1 chiếm 16.7nM, gibberellin3 chiếm 37.8nM và abscisic acid chiếm 65.5nM (Jean W.H. Yong and all, 2009)
* Dịch nghiền của khoai tây: có chứa cacbonhydrat dưới dạng
saccaroza, glucose và fructose, aminoaxit (21 loại bao gồm cả lysine là một axít amin thường không có trong protein thực vật), các muối khoáng (K, Fe, Mg…) và ñặc biệt là các vitamin (C, B1, B6). Dịch nghiền khoai tây thường ñược bổ sung vào môi trường vi nhân giống hoa lan và ñặc biệt có hiệu quả với một số loài như: Phalaenopsis, Doritaenopsis (Thorpe et. al., 2008) [100]. Trong dịch chiết của củ khoai tây thương mại có chứa hàm lượng tinh bột, ñường khử, ñường hòa tan, các enzyme, chất ñiều tiết sinh trưởng nội sinh (các dạng GA, Z, ABA…). Chất ñiều tiết sinh trưởng nội sinh thì thay ñổi phụ thuộc theo tuổi của củ, từng giai ñoạn phát triển diễn biến của củ nhưng có tác dụng thúc ñẩy quá trình sinh trưởng phát triển của tế bào (D L Kang, 2008)
* Dịch nghiền của chuối: chuối chín có tỉ lệ phần trăm tính theo gram của
glucid 16-20%; tinh bột 1,2%; protid 1,32%; lipid 0,5%; theo tỉ lệ phần trăm tính theo mg của calcium 8%, kalium 28%, sắt 0,5% và các vitamin PP 0,07%; vitamin C 0,6%. Còn có nhiều thành phần khác như: Mg, Na, các chloride, phosphate, lưu huỳnh, kẽm. Trong chuối có các hợp chất quan trọng về mặt sinh lý là serotinin, norepinephrine cùng với dopamin và một số catecholamine chưa
xác ñịnh. Việc bổ sung dịch nghiền chuối vào môi trường nuôi cấy hoa lan thường kích thích sự sinh trưởng bởi nó có tác dụng ổn ñịnh pH của môi trường và chứa hợp chất có hoạt tính cytokinin (Van Staden et al., 1975) [105].
Chuối tươi, bột chuối thương mại ñược sử dụng trong nuôi cấy mô tế bào là nguồn cung cấp chất ñiều tiết sinh trưởng tự nhiên như cytokinins và các loại chất ñiều tiết sinh trưởng khác nữa, hơn thế dịch chiết chuối còn là chất phụ gia có tác ñộng ñặc biệt ñến việc thúc ñẩy phát triển tế bàọ Các chất ñiều tiết sinh trưởng nội sinh trong chuối có vai trò quan trọng ñối với ngành nhân giống nuôi cấy mô công nghiệp bởi dịch chiết chuối có hiệu quả tuyệt vời không chỉ ñối với giai ñoạn nhân nhanh mà còn thúc ñẩy cả quá trình tăng trưởng và phát triển của cây con trong nuôi cấỵ Sử dụng các phương pháp tách chiết, tinh sạch như tiếp cận thanh lọc, sắc ký lỏng cao áp, sắc ký lỏng khối phổ, các nhà khoa học ñã xác ñịnh ñược một vài thành phần cytokinins nội sinh trong dịch chiết chuối như trans-zeatin Oglucoside, trans-zeatin riboside, dihydrozeatin O-glucoside và trans-zeatin, ngoài ra trong dịch chuối còn có khoảng 94% của GA3 (Peh,Yunn Chyn, 2007)
* Dịch nghiền của cà rốt: trong 100g cà rốt tươi có 88g nước; 8g
ñường; 1,5g protein; 1,2g xenluloza; 43mg canxi; 39mg phosphate; 0,8mg sắt; 0,06mg vitamin B1; 0,06mg vitamin B2; 0,4mg vitamin PP; 0,8mg vitamin C và từ 1 ñến 9,0mg caroten…Với hàm lượng cao của ñường và các vitamin dịch cà rốt ñược bổ sung vào môi trường nuôi cấy nhằm gia tăng nguồn dinh dưỡng cho mô nuôi cấỵ
* Dịch chiết nấm men, dịch thủy phân casein (casein hydrolysat) hay pepton: chủ yếu ñược sử dụng làm nguồn bổ xung axit amin và các vitamin.
- Chất gel hóa môi trường: ðối với nuôi cấy tĩnh, nếu sử dụng môi trường lỏng, mô có thể bị chìm và sẽ chết vì thiếu ôxỵ ðể tránh tình trạng này, môi trường nuôi cấy ñược làm ñặc lại bằng agar, một loại polysaccarit
chế từ rong biển và mô ñược cấy trên bề mặt của môi trường. Ở 800C agar ngậm nước chuyển sang trạng thái sol, còn ở 400C thì trở về trạng thái gel. Khả năng ngậm nước của agar khá cao: 6- 12 gam/lít nước. Agar ở dạng gel nhưng vẫn ñể cho các ion vận chuyển dễ dàng và có ñộ thoáng khí caọ Agar thường ñược sử dụng ở nồng ñộ 0,6 ñến 1%.
Việc lựa chọn môi trường nuôi cấy với thành phần hoá học ñặc trưng phụ thuộc vào một số yếu tố: ñối tượng cây trồng hoặc mô nuôi cấy khác nhau có nhu cầu khác nhau về thành phần môi trường. Mặt khác, mục ñích nghiên cứu hoặc phương thức nuôi cấy khác nhau (nuôi cấy tạo mô sẹo phôi hoá hoặc phôi vô tính, nuôi cấy tế bào trần hoặc dịch lỏng tế bào, vi nhân giống…) sẽ cần ñến loại môi trường nuôi cấy khác nhau và trạng thái môi trường khác nhau (ñặc, lỏng, bán lỏng…) (Gamborg OL. Kumar AS, Hanning GE and Nabors MW.,1989) [61] và (Dođs J.H và Robert L.W., 1999) [59].