1 D.longicornu
1.2.1Kỹ thuật nhân giống bằng nuôi cấy mô tế bào thực vật
Phương pháp nhân giống bằng nuôi cấy mô, tế bào (nhân giống in vitro) dựa trên cơ sở về tắnh toàn năng và khả năng phân hóa, phản phân hóa của tế bào, mô thực vật. đây là lĩnh vực mà nuôi cấy mô và tế bào thực vật ựã thực sự mang lại hiệu quả kinh tế to lớn (Vũ Văn Vụ và cộng sự, 2001) [57]; (Hoàng Minh Tấn và cộng sự, 2006) [37]. Tắnh ưu việt của phương pháp nhân giống
in vitro là việc sử dụng các mô nuôi cấy có kắch thước nhỏ, sự tương tác giữa
các tế bào trong mô sẽ ựơn giản hơn, mô nuôi cấy dễ phân hóa và sau ựó dễ tái sinh hơn. Ngoài ra, nhân giống vô tắnh in vitro cho phép nhân giống cây trồng ở quy mô công nghiệp (kể cả trên các ựối tượng khó nhân bằng phương pháp thông thường), hệ số nhân cao và cho ra các cá thể sạch bệnh, hoàn toàn ựồng nhất về mặt di truyền. đó là ưu việt mà các phương pháp nhân giống khác không có ựược (Razan MK., 1994) [89], (Hoàng Thị Lan Hương và cộng sự, 2004) [18] và (Võ Hà Giang, Ngô Xuân Bình, 2010) [8].
Kỹ thuật vi nhân giống ựược ứng dụng hiệu quả vào những mục ựắch sau: - Nhân nhanh kết hợp với làm sạnh virut, tạo hàng loạt cây giống có chất lượng cao cung cấp cho sản xuất.
- Nhân nhanh các loài hoa, cây cảnh khó trồng bằng hạt.
- Duy trì và nhân nhanh các kiểu gen quý làm vật liệu cho công tác giống. - Duy trì nhân nhanh các dòng bố mẹ và các dòng lai ựể tạo hạt giống cây rau, cây hoa và các cây trồng khác.
Theo Georger (1993) [62] quá trình nhân giống vô tắnh in vitro bao
gồm các bước sau:
Bước 0: Chọn lọc và chuẩn bị cây mẹ.
Trước khi tiến hành nhân giống in vitro cần chọn lọc cẩn thận các cây mẹ (cây cho nguồn mẫu nuôi cấy). Các cây này cần phải sạch bệnh, ựặc biệt là bệnh virus và ở giai ựoạn sinh trưởng mạnh. Việc trồng các cây mẹ trong ựiều kiện môi trường thắch hợp với chế ựộ chăm sóc và phòng trừ sâu bệnh hiệu quả trước khi lấy mẫu cấy sẽ làm giảm tỷ lệ mẫu nhiễm, tăng khả năng sống và sinh trưởng của mẫu cấy in vitrọ
Bước 1: Nuôi cấy khởi ựộng.
Là giai ựoạn khử trùng ựưa mẫu vào nuôi cấy in vitro. Giai ựoạn này cần ựảm bảo các yêu cầu: Tỷ lệ nhiễm thấp, tỷ lệ sống cao, mô tồn tại và sinh trưởng tốt. Khi lấy mẫu cần chọn ựúng loại mô, ựúng giai ựoạn phát triển của câỵ Quan trọng nhất là ựỉnh chồi ngọn, ựỉnh chồi nách và sau ựó là ựỉnh chồi hoa và cuối cùng là ựoạn thân, mảnh lá... Chồi ngọn, chồi nách ựược sử dụng ựể nhân nhanh các cây: măng tây, dứa, khoai tây, thuốc lá, hoa cúcẦỞ súp lơ thì dùng hoa tự non, ở bầu bắ các mảnh lá mầm là nguyên liệu nuôi cấy thắch hợp ựể nhân nhanh in vitro. Chồi non nảy mầm từ hạt cũng có thể ựược sử dụng làm mẫu cấy ban ựầụ
Bước 2: Nhân nhanh.
Là giai ựoạn kắch thắch mô nuôi cấy phát sinh hình thái và tăng nhanh số lượng thông qua các con ựường: hoạt hóa chồi nách, tạo chồi bất ựịnh và tạo phôi vô tắnh. Vấn ựề là phải xác ựịnh ựược môi trường và ựiều kiện ngoại cảnh thắch hợp ựể có hiệu quả cao nhất. Theo nguyên tắc chung môi trường có nhiều cytokinin sẽ kắch thắch tạo chồị Chế ựộ nuôi cấy thường là 25-270C và 16 giờ chiếu sáng/ngày, cường ựộ ánh sáng 2000-4000 lux. Tuy nhiên ựối với mỗi loại ựối tượng nuôi cấy ựòi hỏi có chế ựộ nuôi cấy khác nhau: nhân nhanh súp lơ cần quang chu kì chiếu sáng 9giờ/ngày, nhân nhanh phong lan
Phaleanopsis ở giai ựoạn ựầu cần che tốị.. Bước 3: Tạo cây in vitro hoàn chỉnh.
để tạo rễ cho chồi, người ta chuyển chồi từ môi trường nhân nhanh sang môi trường tạo rễ. Môi trường tạo rễ thường ựược bổ sung một lượng nhỏ auxin. Một số chồi có thể phát sinh rễ ngay sau khi chuyển từ môi trường nhân nhanh giàu cytokinin sang môi trường không chứa chất ựiều tiết sinh trưởng. Theo Murashige, giai ựoạn này là giai ựoạn ưu tiên cho sự tạo rễ của chồi ựể sau ựấy có thể chuyển chúng sang môi trường trồng trọt tự nhiên. Tạo rễ cho chồi là một phần rất quan trọng của bất kỳ quy trình nhân in vitro nàọ đôi khi một số chồi cần ựược kéo dài trước khi tạo rễ. để giảm chi phắ nhân giống, nhiều phòng thắ nghiệm chuyển chồi không rễ từ môi trường in vitro và tạo rễ ở bên ngoài phòng nuôi cấỵ
Theo Debergh và Maene (1981) giai ựoạn này thường ựược chia thành: + Giai ựoạn a: kéo dài mầm hoặc chồi tạo thành ựể cung cấp chồi có kắch thước thắch hợp cho giai ựoạn tiếp theọ
+ Giai ựoạn b: tạo rễ cho chồi in vitro hoặc ngoài tự nhiên (extra vitrum).
Bước 4: Thắch ứng cây in vitro ngoài ựiều kiện tự nhiên.
để ựưa cây từ ống nghiệm ra vườn ươm với tỷ lệ sống cao, cây sinh trưởng tốt cần ựảm bảo một số yêu cầu:
+ Cây trong ống nghiệm ựã ựạt những tiêu chuẩn hình thái nhất ựịnh (số lá, số rễ, chiều cao cây).
+ Có giá thể tiếp nhận cây in vitro thắch hợp: giá thể sạch, tơi xốp,
thoát nước.
+ Phải chủ ựộng ựiều chỉnh ựược ẩm ựộ, sự chiếu sáng của vườn ươm cũng như có chế ựộ dinh dưỡng phù hợp.
Có hai lý do chắnh gây khó khăn cho giai ựoạn này mà cần phải khắc phục là: + Chồi in vitro ựược tạo ra trong môi trường có ựộ ẩm cao và cường ựộ ánh sáng thấp. điều này làm cho lá có ắt lớp sáp hoặc sáp có thành phần hóa học thay ựổi so với những cây mọc trong tự nhiên hay trong nhà kắnh. Một số cây in
vitro, khắ khổng của lá có thể không bình thường, không có khả năng ựóng hoàn
toàn trong ựiều kiện ựộ ẩm tương ựối thấp. Do ựó cây in vitro mất nước nhanh hơn khi ựưa ra môi trường bên ngoài (Sutter và Langhans, 1979, 1980).
+ Cây con in vitro là các cơ thể dị dưỡng, nguồn dinh dưỡng và năng lượng ựều do môi trường nuôi cấy cung cấp. Khi ựưa ra ựiều kiện tự dưỡng, ựiều này ựòi hỏi thời gian và ựiều kiện phù hợp ựể cây làm quen (Marin và Gella, 1987). Sự chuyển sang trạng thái tự dưỡng chỉ xảy ra sau khi cây ựó làm quen với ựiều kiện tự nhiên một thời gian (Trigiano RN and Gray DJ., 2000) [102].