1 D.longicornu
1.2.2 Nhân giống bằng bioreactor
Nhân giống bằng kỹ thuật nuôi cấy mô truyền thống thường ñược sử dụng trên môi trường có agar (thạch) phải trải qua nhiều công ñoạn nuôi cấy, tỷ lệ mẫu nhiễm tăng, nhân công lao ñộng nhiều qua các khâu trong quá trình nhân giống, do ñó cần có một hệ thống nhân giống hiện ñại có thể nâng tần
suất nhân giống lên quy mô công nghiệp là cần thiết ñể giảm thấp chi phí sản xuất, giảm giá thành cây giống (Trần Văn Minh, 1999) [3] và (Nguyễn ðức Lương và cộng sự, 2002) [26].
Sau ñó ñã có nhiều nghiên cứu cải tiến ñược sử dụng phương pháp nuôi cấy trên môi trường lỏng có hay không có lắc, kết quả bước ñầu ñã nâng cao ñược hệ số nhân, giảm ñược giá thành cây giống nhưng phát sinh khi nuôi cấy trong môi trường lỏng có hay không có lắc thì mẫu cấy bị trương dẫn ñến hiện tượng thủy tinh thể do ngập quá lâu trong môi trường lỏng hoặc mẫu còn bị những tổn thương trong quá trình lắc.
Nhân giống trên quy mô lớn thực vật qua nuôi cấy phôi, mô, tế bào bằng kỹ thuật bioreactor ñang có nhiều triển vọng trong nhân giống cây trồng quy mô công nghiệp. Bioreactor sử dụng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật ñược cải tiến từ các loại bioreactor trong nuôi cấy tế bào vi sinh. Những bioreator chuyên biệt với môi trường lỏng thích hợp ñã ñược nghiên cứu và phát triển trên quy mô công nghiệp, hạn chế thấp nhất những vấn ñề hoại tử do chồi in vitro bị thủy tinh thể và chi phí giảm thấp (Preil, 1991), (Ziv, 1999).
Ứng dụng công nghệ Bioreator trong nhân giống cho việc tái sinh chồi cao tránh các bệnh sinh lý và chủ ñộng sản xuất giống quanh năm trên những cây trồng có giá trị. Trong bioreactor có hệ thống cung cấp, xả môi trường; hệ thống cấp, thoát khí vô trùng ñược thiết kế khoa học tạo ra một môi trường nuôi cấy vô trùng và kiểm soát ñược các yếu tố lý, hóa ở môi trường bên trong thùng nuôi cấy như ñiều chỉnh tốc ñộ lắc, mật ñộ thoáng khí, nhiệt ñộ dung dịch nuôi cấy, lượng oxy hòa tan, pH...) (Kozai et al., 1986) [75] và (Nguyễn Cữ Thành Nhân và cộng sự, 2007) [30]. Hệ thống bioreactor có ba loại chính ñược phân biệt như sau:
- Loại dùng ñể sản xuất sinh khối (nhân nhanh khối tế bào, các ñơn vị phát sinh phôi, phát sinh cơ quan, chồi, rễ)
- Loại dùng ñể sản xuất các chất chuyển hóa thứ cấp, enzyme
- Loại dùng cho việc chuyển hoá sinh học các chất chuyển hóa ngoại sinh (là các chất tiền thân trong quá trình trao ñổi chất)
Một số loại bioreactor hiện ñang ñược sử dụng trong nhân giống in vitro: + Bioreacter sục khí và sủi bọt hình trụ: cả 2 hình thức này ñều sử dụng khí vô trùng nhưng khác nhau về sự luân chuyển môi trường lỏng và thủy ñộng học. Trở ngại khi sử dụng Bioreacter sục khí là sự tạo bọt và sinh trưởng trên thành bình, ñể chống tạo bọt phải sử dụng các sản phẩm có nguồn gốc silicon, nhưng ảnh hưởng của silicon ñến sinh trưởng, trao ñổi chất của tế bào thì còn chưa ñược làm rõ (Leathers et al., 1995; Lee,1997)
+ Bioreacter sủi bọt hình cầu: giải quyết ñược những hạn chế của bioreacter sủi bọt hình trụ, do hạn chế ñược thấp nhất sự tạo bọt, giảm sinh trưởng thành tế bào, thích hợp cho nuôi cấy và thu nhận rễ, nuôi cấy tế bào liên tục và thu nhận hoạt chất. Thể tích thiết kế hiện nay từ 300 - 500 lit (Seon et al., 1998).
+ Bioreacter cánh khuấy: Hệ thống này thuận lợi cho việc trộn và phá vỡ sự liên kết thể khí, ngăn chặn sự liên kết tế bào trên thành bình và gia tăng trao ñổi oxigen (Hooker & Lee, 1990). Tuy nhiên hệ thống ñiều khiển phức tạp, cần ñiều chỉnh tốc ñộ cánh khuấy, nuôi cấy tế bào và thể nhân giống dễ bị tác ñộng của lực nước (Leathers et al., 1995).
+ Bioreacter bán chìm nổi: Hệ thống này làm thời gian tiếp xúc với môi trường dinh dưỡng, các chất kích thích sinh trưởng thích ứng với giai ñoạn nuôi cấy phát sinh phôi và các cơ quan khác, thích hợp với nhiều loại cây trồng. Hệ thống này có thể thay thế trong giai ñoạn cấy truyền trong nhân giống truyền thống, hạn chế chi phí lao ñộng.
Việc lựa chọn hệ thống bioreacter phụ thuộc vào nhiều yếu tố: loại tế bào, quy mô nuôi cấy, phương pháp khuấy trộn, phương pháp thổi khí, khả
năng sinh trưởng và trao ñổi chất của tế bào trong môi trường nhân in vitro.
Mỗi chủng loại bioreacter thường chỉ thích ứng với một số cây trồng và dòng tế bào nuôi nhất ñịnh. Quy trình nhân giống trong bioreactor ñược làm rõ về: môi trường nuôi cấy, EC, pH, ánh sáng, nhiệt ñộ, nhịp ñiệu chìm nổi, lưu lượng hỗn hợp khí vô trùng (Russell GẸ, 1988) [93], (Stewart L.Scott and Kane E Michael, 2006)[98] và (Thorpe TA, Stasolla C, Yeung EC, de Klerk G-J, Roberts, George EF, 2008) [100].