1 D.longicornu
2.3.1 Bố trí thí nghiệm
2.3.1.1 Nghiên cứu lựa chọn phương pháp khử trùng và cơ quan nuôi cấy ñể
tạo nguồn vật liệu in vitro với hai loài lan bản ñịa nghiên cứu
Thí nghiệm 1: Xác ñịnh hiệu quả khử trùng ñối với chồi mầm trong H2O2 2% và HgCl2 0,1% của hai loài lan bản ñịa D.nobile và D.chrysanthum
Thí nghiệm ñược tiến hành từ tháng 6/ 2009 ñến tháng 9/ 2009, ñược tiến hành trên chồi mầm (dài 1,8cm-2cm) của 2 loài lan, 03 công thức, thí nghiệm ñược bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, 03 lần nhắc, mỗi lần nhắc 30 mẫu/ loài/ công thức. Nền môi trường cấy mẫu (MS+100ml nước dừa+10g saccaroza+ 6g agar)/lít.
+ CT1: Sử dụng H2O2 2% kép, lần 1 trong 5 phút và lần 2 trong 2 phút. + CT2: Sử dụng H2O2 2% và HgCl2 0,1%; lần 1 trong H2O2 2% 5 phút, lần 2 trong HgCl2 0,1% 1 phút.
+ CT3: Sử dụng HgCl2 0,1% kép, lần 1 trong 3 phút và lần 2 trong 1 phút.
Thí nghiệm 2: Xác ñịnh phương pháp khử trùng ñối với quả lan trên hai loài lan bản ñịa D.nobile và D.chrysanthum
Thí nghiệm ñược tiến hành từ tháng 8/ 2009 ñến tháng 10/ 2009, trên mẫu quả lan (5 tháng tuổi) của 02 loài lan bản ñịa, 03 công thức, thí nghiệm ñược bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, 03 lần nhắc, mỗi lần nhắc 30 quả/ loài/ công thức. Gieo hạt vào môi trường (MS+100ml nước dừa+10g saccaroza+ 6g agar)/lít.
+ CT1: Nhúng quả trong cồn 960, ñốt trên ngọc lửa ñèn cồn.
+ CT2: Nhúng quả trong cồn 960, ngâm tiếp trong H2O2 2% trong 5 phút. + CT3: Nhúng quả trong cồn 960, ngâm tiếp trong HgCl2 0,1% trong 5 phút.
2.3.1.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố ñến khả năng nhân nhanh, tạo cây hoàn chỉnh in vitro ñối với hai loài lan bản ñịa D.nobile và D.chrysanthum theo phương pháp nuôi cấy mô truyền thống
Bao gồm 11 thí nghiệm: Thí nghiệm3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 ñược tiến hành từ tháng 1/ 2010 ñến tháng 10/ 2010
Các thí nghiệm 3, 5, 7 và 8 ñược bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, 03 lần nhắc, mỗi lần nhắc cấy 03 bình, mỗi bình cấy 3 cụm thể sinh chồi
(protocorm); 50 thể sinh chồi (protocorm)/ cụm.
Các thí nghiệm 4, 6, 9 và 10 ñược bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, 03 lần nhắc, mỗi lần nhắc cấy 03 bình, mỗi bình cấy 3 cụm chồi, 15 chồi/ cụm.
Các thí nghiệm 11, 12 và 13 ñược bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, 03 lần nhắc, mỗi lần nhắc cấy 03 bình, mỗi bình cấy 05 chồi có chiều cao 3,5 cm; 3 lá.
Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của các nền môi trường cơ bản ñến khả năng nhân nhanh thể sinh chồi (protocorm) của loài lan bản ñịa D.nobile
+ CT1: Môi trường Vacin and Went, 1949 + CT2: Môi trường KnudsonC, 1965
+ CT3: Môi trường Murashige-Skoog, 1962 + CT4: Môi trường Robert Ernst, 1979
Tất cả các công thức ñều ñược bổ sung (100ml nước dừa + 10g saccaroza + 6g agar)/ lít
Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng của các nền môi trường cơ bản ñến khả năng
nhân nhanh cụm chồi của hai loài lan bản ñịa D.nobile và D.chrysanthum + CT1: Môi trường Vacin and Went, 1949
+ CT2: Môi trường KnudsonC, 1965
+ CT3: Môi trường Murashige-Skoog, 1962 + CT4: Môi trường Robert Ernst, 1979
Tất cả các công thức ñều bổ sung (100ml nước dừa + 10g saccaroza +
Thí nghiệm 5: Ảnh hưởng của hàm lượng saccaroza ñến khả năng nhân
nhanh thể sinh chồi (protocorm) của loài lan bản ñịa D.nobile + CT1: Nền + 10g saccaroza/lít
+ CT2: Nền + 20g saccaroza/ lít + CT3: Nền + 30g saccaroza/ lít + CT4: Nền + 40g saccaroza/ lít + CT5: Nền +50g saccaroza/ lít
Nền là công thức tốt nhất của thí nghiệm 3, không bổ sung saccaroza
Thí nghiệm 6: Ảnh hưởng của hàm lượng saccaroza ñến khả năng nhân nhanh cụm chồi của hai loài lan bản ñịa D.nobile và D.chrysanthum
+ CT1: Nền + 10g saccaroza/ lít + CT2: Nền + 20g saccaroza/ lít + CT3: Nền + 30g saccaroza/ lít + CT4: Nền + 40g saccaroza/ lít + CT5: Nền + 50g saccaroza/ lít
Nền là công thức tốt nhất của thí nghiệm 4, không bổ sung saccaroza
Thí nghiệm 7: Ảnh hưởng của dịch nghiền hợp chất hữu cơ tự nhiên ñến
khả năng nhân nhanh thể sinh chồi (protocorm) của loài lan bản ñịa D.nobile + CT 1: ðC + CT 2: ðC + 60g khoai tây/lít + CT 3: ðC + 60g cà rốt/lít + CT 4: ðC + 60g táo/ lít + CT 5: ðC + 60g chuối chín/lít + CT 6: ðC + (60g khoai tây + 60g cà rốt)/ lít + CT 7: ðC + (60g khoai tây + 60g táo)/ lít
+ CT 8: ðC + (60g khoai tây + 60g chuối chín)/ lít + CT 9: ðC + (60g cà rốt + 60g táo)/ lít
+ CT 10: ðC + (60g cà rốt + 60g chuối chín)/ lít + CT 11: ðC + (60g táo + 60g chuối chín)/ lít ðC là công thức tốt nhất của thí nghiệm 5
Cách tiến hành: Các loại củ quả như khoai tây, cà rốt, táo, chuối chín ñược chọn loại thương phẩm, tươi, cắt bỏ các phần không ăn ñược, rửa sạch cả vỏ, cân ñủ lượng rồi nghiền bằng máy xay sinh tố.
Thí nghiệm 8: Ảnh hưởng của hàm lượng khoai tây ñến khả năng nhân
nhanh thể sinh chồi (protocorm) của loài lan D.nobile + CT1: ðC + CT2: ðC + 20g khoai tây/ lít + CT3: ðC + 40g khoai tây/ lít + CT4: ðC + 60g khoai tây/ lít + CT5: ðC + 80g khoai tây/ lít + CT6: ðC + 100g khoai tây/ lít ðC là công thức tốt nhất của thí nghiệm 5
Thí nghiệm 9: Ảnh hưởng của dịch nghiền hợp chất hữu cơ tự nhiên ñến
khả năng nhân nhanh cụm chồi của hai loài lan bản ñịa D.nobile và D.chrysanthum + CT 1: ðC + CT 2: ðC + 60g khoai tây/ lít + CT 3: ðC + 60g cà rốt/ lít + CT 4: ðC + 60g táo / lít + CT 5: ðC + 60g chuối chín/ lít + CT 6: ðC + (60g khoai tây + 60g cà rốt)/ lít + CT 7: ðC + (60g khoai tây + 60g táo)/ lít
+ CT 8: ðC + (60g khoai tây + 60g chuối chín)/ lít + CT 9: ðC + (60g cà rốt + 60g táo)/ lít
+ CT 10: ðC + (60g cà rốt + 60g chuối)/lít + CT 11: ðC + (60g táo + 60g chuối)/ lít
ðC = Công thức tốt nhất của thí nghiệm 6
Thí nghiệm 10: Ảnh hưởng của hàm lượng chuối chín ñến khả năng nhân nhanh cụm chồi trên hai loài lan bản ñịa D.nobile và D.chrysanthum
+ CT1: ðC + CT2: ðC + 30g chuối chín/ lít + CT3: ðC + 60g chuối chín/ lít + CT4: ðC + 90g chuối chín/ lít + CT5: ðC + 120g chuối chín/ lít + CT6: ðC + 150g chuối chín/ lít + CT7: ðC+ 180g chuối chín/ lít ðC là công thức tốt nhất của thí nghiệm 6
Thí nghiệm 11: Ảnh hưởng của nền môi trường cơ bản ñến sinh trưởng
của chồi lan với hai loài lan bản ñịa D.nobile và D.chrysanthum + CT1: Môi trường Vacin and Went, 1949
+ CT2: Môi trường KnudsonC, 1965
+ CT3: Môi trường Murashige-Skoog, 1962 + CT4: Môi trường Robert Ernst, 1979
Tất cả các công thức ñều bổ sung (10g saccaroza + 6g agar)/ lít.
Thí nghiệm 12: Nghiên cứu ảnh hưởng của cường ñộ ánh sáng tới khả năng sinh trưởng của chồi lan D.nobile và D.chrysanthum
+ CT1: Nền + 1 ñèn chiếu sáng = 800lux + CT2: Nền + 2 ñèn chiếu sáng = 1300lux + CT3: Nền + 3 ñèn chiếu sáng = 1800lux + CT4: Nền + 4 ñèn chiếu sáng = 2300lux
Nền là công thức tốt nhất của thí nghiệm 11 ñối với từng loài lan Các bình nuôi ñược xếp trên dàn nuôi cấy có kích thước chiều dài: chiều rộng = 1,34 m: 0,69 m; ðộ rọi sáng ñược ño bằng máy Luxmeter cầm taỵ
Thí nghiệm 13: Nghiên cứu ảnh hưởng của than hoạt tính (THT) ñến khả năng tạo rễ của chồi hai loài lan bản ñịa D.nobile và D.chrysanthum.
+ CT1: ðC
+ CT2: ðC + 0,5g than hoạt tính/lít + CT3:ðC + 1,0g than hoạt tính /lít + CT4: ðC + 1,5g than hoạt tính /lít + CT5: ðC + 2,0g than hoạt tính /lít
ðC là công thức tốt nhất của thí nghiệm 12 ñối với từng loài lan 2.3.1.3 Nghiên cứu khả năng nhân nhanh in vitro ñối với hai loài lan bản ñịa
D.nobile và D.chrysanthum theo phương pháp nuôi cấy cải tiến
Các thí nghiệm 14, 15, 16,17 ñược bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, 03 lần nhắc lại, mỗi công thức 05 bình; mỗi bình cấy 03 cụm thể sinh chồi (protocorm);50 thể sinh chồi (protocorm)/cụm; ñược ñặt trong phòng nuôi cây
Thí nghiệm 14: Nghiên cứu ảnh hưởng của phương thức nuôi cấy khi
sử dụng nút bông ñến khả năng nhân nhanh thể sinh chồi (protocorm) ñối với loài lan bản ñịa D.nobile
+ CT1: Nền + nút bông, môi trường ñặc + CT2: Nền + nút bông, môi trường lỏng tĩnh + CT3: Nền + nút bông, môi trường lỏng lắc Nền là công thức tốt nhất của thí nghiệm 8
Thí nghiệm 15: Nghiên cứu ảnh hưởng của phương thức nuôi cấy khi
sử dụng nút bằng màng lọc thoáng khí ñến khả năng nhân nhanh thể sinh chồi (protocorm) ñối với loài lan bản ñịa D.nobile
+ CT1: Nền + nút màng lọc, môi trường ñặc + CT2: Nền + nút màng lọc, môi trường lỏng tĩnh + CT3: Nền + nút màng lọc, môi trường lỏng lắc Nền là công thức tốt nhất của thí nghiệm 8.
Màng lọc thoáng khí ñược sử dụng trong thí nghiệm thuộc loại: Cellulose Acetate, kích thước lỗ lọc là 0,2µm
Thí nghiệm 16: Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng saccaroza ñến quá trình nhân nhanh thể sinh chồi (protocorm) trong nuôi cấy ñặc có màng lọc thoáng khí ñối với loài lan bản ñịa D.nobile
+ CT1: Nền + nút màng lọc + 0g saccaroza + CT2: Nền + nút màng lọc + 2,5g saccaroza + CT3: Nền + nút màng lọc + 5,0g saccaroza + CT4: Nền + nút màng lọc + 7,5g saccaroza + CT5: Nền + nút màng lọc +10,0g saccaroza
Nền là công thức tốt nhất của thí nghiệm 8, không bổ sung saccaroza
Màng lọc thoáng khí ñược sử dụng trong thí nghiệm thuộc loại: Cellulose Acetate, kích thước lỗ lọc là 0,2µm
Thí nghiệm 17: Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng saccaroza ñến quá trình nhân nhanh thể sinh chồi (protocorm) trong nuôi cấy lỏng lắc có màng lọc thoáng khí ñối với loài lan bản ñịa D.nobile
+ CT1: Nền + nút màng lọc+lỏng lắc + không saccaroza + CT2: Nền + nút màng lọc+lỏng lắc + 2,5g saccaroza + CT3: Nền + nút màng lọc+lỏng lắc + 5,0g saccaroza + CT4: Nền + nút màng lọc+lỏng lắc + 7,5g saccaroza + CT5: Nền + nút màng lọc+lỏng lắc + 10,0g saccaroza Nền là công thức tốt nhất của thí nghiệm 8, không bổ sung saccaroza
Màng lọc thoáng khí ñược sử dụng trong thí nghiệm thuộc loại: Cellulose Acetate, kích thước lỗ lọc là 0,2µm
ñến khả năng nhân nhanh cụm chồi ñối với loài lan bản ñịa D.chrysanthum Thí nghiệm có 5 công thức, ñược bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên.
Công thức 1, công thức 2 và công thức 3: 03 lần nhắc, 80ml môi trường nhân chồi/ bình, mỗi công thức cấy 05 bình; mỗi bình cấy 03 cụm chồi, 15 chồi/cụm. Màng lọc thoáng khí ñược sử dụng trong thí nghiệm thuộc loại: Cellulose Acetate, kích thước lỗ lọc là 0,2µm
Công thức 4: 03 lần nhắc lại, 04 lít môi trường nhân chồi/ bình, bình cấy 150 cụm, 15 chồi/cụm.
Hệ thống bioreactor ở chế ñộ khuấy 200 vòng/phút, cường ñộ chiếu sáng 800lux. Hệ thống ñược ñặt tại phòng nuôi câỵ
+ CT1: Nền + nút màng lọc+ ñặc + CT2: Nền + nút màng lọc+ lỏng tĩnh + CT3: Nền + nút màng lọc+ lỏng lắc + CT4: Nền + hệ thống bioreactor Nền là công thứctốt nhất của thí nghiệm 10
2.3.1.4 Nghiên cứu ảnh hưởng thời vụ ra cây, giá thể, chế phẩm dinh dưỡng ñến tỷ lệ sống, ñộng thái tăng chiều cao, số lá của cây con in vitro hai loài lan bản ñịa D.nobile và D.chrysanthum tại vườn ươm, vườn sản xuất
Các thí nghiệm 19, 20 và 21 ñược bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, mỗi công thức trồng 30 cây, chọn cây in vitro ñồng loạt với loài D.nobile có chiều cao: 4cm, số lá: 3 lá, số rễ: 4 rễ; với loài D.chrysanthum có chiều cao: 5cm, số lá: 5 lá, số rễ: 4 rễ. Trồng cây vào rổ nhựa ñã ñược lót lưới ñể trải lớp bột xơ dừa dày 07cm, rổ nhựa có kích thước(Dài: 58cmxRộng: 38cmxCao:12cm), trồng cây cách cây 3cm, hàng cách hàng 4 cm.
Ghi chú: Cả 03 thí nghiệm, cây in vitro 02 loài lan bản ñịa D.nobile và
D.chrysanthum ñược rút ra khỏi bình an toàn, rửa sạch agar cũng như các chất
bám dính nhiều lần dưới vòi nước máy, tránh làm gãy hay giập nát cây, ñặt cây ñã rửa sạch lên giấy thấm cho khô hết nước, sau ñó ngâm khử trùng cây
bằng dung dịch KMn04 0,1% trong 5 phút hoặc trong dung dịch thuốc Vicarben 0,1% trong 5 phút. Sau khi cây ráo nước, ñược ñem ñi trồng.
Thí nghiệm 19: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời vụ ra cây ñến tỷ lệ sống cây
in vitro vườn ươm của hai loài lan bản ñịa D.nobile và D.chrysanthum
Thí nghiệm tiến hành trên 02 loài lan với 3 công thức; trồng cây trên cùng giá thể bột xơ dừa, cây ñược tưới giữ ẩm hàng ngàỵ
+ CT1: Vụ Xuân, 08/2/2011 + CT2: Vụ Hè, 02/5/2010 + CT3: Vụ Thu, 03/9/2010
Thí nghiệm 20: Nghiên cứu ảnh hưởng của giá thể ñến tỷ lệ sống và chất lượng cây in vitro vườn ươm của hai loài lan bản ñịa D.nobile và D.chrysanthum
Thí nghiệm tiến hành trên 02 loài lan với 4 công thức; Cây ñược trồng vào vụ xuân (08/2/2011), ñược trồng vào các loại giá thể theo từng công thức, ñược tưới giữ ẩm hàng ngàỵ
+ CT1: Bột xơ dừa + CT2: Xơ dừa
+ CT3: Bột xơ dừa: Xơ dừa, theo tỷ lệ 1:1
+ CT4: Than củi có kích thước viên 0,5cmx0,5cmx0,5cm
Thí nghiệm 21: Nghiên cứu ảnh hưởng của các chế phẩm dinh dưỡng
ñến chiều cao, số lá cây in vitro trên hai loài lan bản ñịa (D.nobile và
D.chrysanthum) ngoài vườn ươm.
Thí nghiệm tiến hành trên 02 loài lan bản ñịa (thu thập ñang ở giai ñoạn sinh trưởng) với 5 công thức, các cây ñược trồng vào vụ Xuân (08/2/2011) trên cùng giá thể bột xơ dừạ Các cây ñược tưới giữ ẩm bằng nước lã trong 01 tháng. Sau 1 tháng sử dụng các loại chế phẩm dinh dưỡng, ñịnh kỳ ñịnh kỳ 01 lần/ tuần theo từng công thức thí nghiệm. Nồng ñộ pha của từng loại chế
phẩm dinh dưỡng ñều theo chỉ dẫn ghi trên bao bì, phun ướt toàn bộ thân lá, lượng phun khoảng 100ml/lần/ khay trồng 30 cá thể. Các ngày không tưới chế phẩm dinh dưỡng ñảm bảo ẩm ñộ của giá thể trồng bằng nước lã.
+ CT1: Phun nước lã + CT2: Phun Antonic + CT3: Phun Yogen + CT4: Phun Komix + CT5: Phun Growmore
2.3.1.5 Nghiên cứu ảnh hưởng giá thể, chế phẩm dinh dưỡng ñến sinh trưởng phát triển trong giai ñoạn nuôi trồng cây thu thập của hai loài lan bản
ñịa D.nobile và D.chrysanthum
Thí nghiệm 22: Nghiên cứu ảnh hưởng của giá thể trồng ñến sinh trưởng
trên hai loài lan bản ñịa thu thập D.nobile và D.chrysanthum ở vườn sản xuất. Cả hai thí nghiệm ñược tiến hành trên 02 loài lan với 4 công thức, ñược bố trí ngẫu nhiên, 03 lần lặp lại, mỗi công thức trồng 10 chậụ Các cây có cùng chiều cao, ñường kính thân, số thân/ khóm, cùng ñược trồng trong chậu ñất nung có kích thước (25cm x 18cm x 15cm).
Cây ñược trồng vào giá thể theo công thức. Các cây ñược tưới giữ ẩm hàng ngày và cùng ñược tưới chế phẩm dinh dưỡng yogen ñịnh kỳ 01 lần/ tuần.
+ CT1: Than củi + CT2: Xơ dừa + CT3: Gỗ nhãn + CT4: Dương xỉ
Thí nghiệm 23: Ảnh hưởng của chế phẩm dinh dưỡng qua lá ñến sinh
trưởng của hai loài lan bản ñịa thu thập D.nobile và D.chrysanthum
Thí nghiệm tiến hành trên 02 loài lan với 05 công thức, các cây ñược trồng trên cùng giá thể xơ dừạ
theo từng công thức thí nghiệm. Nồng ñộ pha của từng loại chế phẩm dinh dưỡng, theo chỉ dẫn ghi trên từng loại bao bì, phun ướt toàn bộ thân lá, lượng phun khoảng 200ml/lần/ 10 chậu trồng. Các ngày khác vẫn ñảm bảo ẩm ñộ của giá thể trồng cây trong khoảng 40% .
+ CT1: Phun chế phẩm Antonic + CT2: Phun chế phẩm Yogen + CT3: Phun chế phẩm Growmore + CT4: Phun chế phẩm ðầu trâu