1 D.longicornu
1.3.5 Ảnh hưởng của phương thức nuôi cấy
1.3.5.1 Nuôi cấy trong môi trường lỏng
Các kết quả về cấy mô cho biết rằng, môi trường lỏng ñược xáo trộn trên máy lắc có hiệu quả hơn môi trường ñặc. Tốc ñộ quay của máy lắc thay ñổi tùy theo loài lan và giai ñoạn cấỵ Trong giai ñoạn ñầu, qua bộ phận biến trở, chúng ta ñiều chỉnh máy lắc với tốc ñộ 1/4 - 1/5 vòng/phút, tốc ñộ này nhằm mục ñích làm cho môi trường dinh dưỡng hòa ñều, sau ñó tốc ñộ tăng dần 100 vòng/phút phổ biến cho các loài, 160 vòng/phút cho Cattleya và Dendrobium 200 - 230
vòng/phút cho Cymdium. Thời gian của mô quay trên máy lắc có thể thay ñổi tùy loài lan, thường từ 3 - 4 tuần (Sagawa Ỵ Biotechnology in orchid, In: KimuraT, S Ichihashi, H Nagata (eds) Proc. Nagaya Intl. Orchid Show 1990) [94].
Năm 1963, Donald ẸVimber ñã nghiên cứu trên nhân giống
Cymbidium, nhưng nuôi cấy mô trên môi trường lỏng và cũng cho kết quả tốt,
tạo ra hàng trăm cây con từ một mô nuôi cấy trong thời gian ngắn (Trần Văn Huân, Văn Tích Lượm, 2002) [15].
Ở nước ta, các tác giả ñã chứng minh ñược khi nuôi cấy thể PLB của Hồ ñiệp trên môi trường lỏng tĩnh và lỏng lắc cho hệ số nhân PLB lần lượt là 5,05 và 8,3 lần trong 6 tuần, trong khi nuôi cấy trên môi trường ñặc hệ số này chỉ ñạt là 3,6 (Cung Hoàng Phi Phượng và cộng sự, 2007) [33].
4.3.5.2 Nuôi cấy thoáng khí và ảnh hưởng của chếñộ chiếu sáng
Nguyễn Ngọc Quỳnh và cộng sự (2009) tại Viện Sinh học Nhiệt ñới thành phố Hồ Chí minh ñã chứng minh ñược chồi lan Dendrobium Burana
White nuôi cấy in vitro tăng trưởng tốt hơn khi nuôi cấy trong hệ thống bơm khí trực tiếp so với phương pháp trao ñổi khí tự nhiên và tiếp tục tăng trưởng tốt hơn khi ra vườn ươm. Theo Vũ Ngọc Phượng, Thái Xuân Du (2007) [35] có thể sử dụng ánh sáng tự nhiên như một giải pháp tiết kiệm ñiện máy lạnh và ñèn chiếu sáng ñể nuôi cấy phong lan Dendrobium, Doritanopsis và
Catleya. Dendrobium có tốc ñộ lớn nhanh hơn Doritanopsis và Catleya. Khi
sử dụng tinh bột thay cho ñường, tỷ lệ mẫu nhiễm giảm. Lượng agar dùng làm ñông môi trường giảm ñị Trong ñiều kiện ánh sáng tự nhiên chiếu sáng mạnh cây có sắc tố tím ñỏ. Trên ñối tượng là cây Dendrobium, Doritanopsis và
Catleya kết quả ño ñạc cho thấy ở môi trường ánh sáng tự nhiên việc sử dụng
carbohydrat ở dạng tinh bột tốt hơn so với dùng ñường. Kể từ ngày 30 trở ñi bắt ñầu ghi nhận ñược sự khác biệt và thời gian nuôi cấy càng kéo dài về sau thì sự vượt trội của tinh bột ngày càng rõ rệt (Honjo và Takakura,1987) [65] và (Vũ Ngọc Phượng và cộng sự, 2007) [34].
Nuôi cấy in vitro thoáng khí là việc tạo ra sự trao ñổi khí tự nhiên giữa trong và ngoài bình hoặc bơm thêm không khí hay CO2 vào bình nuôi cấỵ
ðiều kiện thoáng khí kết hợp với gia tăng cường ñộ chiếu sáng sẽ tạo ñiều kiện ñể thuận lợi ñể mẫu cấy có thể quang hợp và do ñó dẫn ñến hạn chế hay loại bỏ việc bổ sung nguồn các bon hữu cơ vào môi trường dinh dưỡng. Ý tưởng này ñã ñược các nhà nghiên cứu Nhật Bản khởi xướng và phát triển trong nhiều thập niên vừa qua (Kozai et al., 1987) [75]. Với lan Cymbidium, Honjo và Takakura (1987) [65] ñã nhân giống quang tự dưỡng PLB trong môi trường có nồng ñộ CO2 ñạt 3000 µmol/mol. Tác giả Heo J. W., Kubota C., Kozai T.(1996) [64] ñã khẳng ñịnh cây con của Cymbidium sinh trưởng tốt
hơn khi nuôi cấy quang tự dưỡng ở ñiều kiện nồng ñộ CO2 ñạt 1000
µmol/mol, cường ñộ chiếu sáng 100 µmol/m2.s và không bổ sung ñường vào môi trường dinh dưỡng so với nuôi cấy dị dưỡng (có ñường, nồng ñộ CO2 ñạt 500 µmol/mol, cường ñộ chiếu sáng 50 µmol/m2.s)
1.3.5.3 Nuôi cấy bằng bioreactor
* Những nghiên cứu trong nước về vi nhân giống lan trong bioreactor
Ở Việt Nam công nghệ bioreactor bước ñầu ñã ñược một số tác giả nghiên cứu trên các cây hoa lily, hồng môn, cây thân gỗ như bạch ñàn, trầm hương, cây ăn quả có múi (ðỗ Năng Vịnh, 2002) [56].
Với cây lan, một số tác giả ñã bước ñầu nghiên cứu nhân giống in vitro trong bioreactor. Năm 2007, Dương Tấn Nhật và Nguyễn Thành Hải ñã nhân thành công các thể PLB (Protocorm - like body) của Hồ ñiệp (Phalaenopsis sp.) và ðịa lan (Cymbidium sp.) trong bioreactor hình cầu sục khí. Khi nhân trong bioreactor ñã làm tăng tỷ lệ sống sót, hệ số nhân và khối lượng trung bình của PLB gấp ñôi so với nuôi cấy trên môi trường ñặc (Huan LVT, M Tanaka,
2004b) [66] và (Dương Tấn Nhật và cộng sự, 2007) [30]. Cũng trong thời
gian này các tác giả ñã sử dụng hệ thống bioreactor ngập chìm tạm thời trong nhân nhanh PLB lan Hồ ñiệp và ñạt ñược hệ số nhân 10,2 lần sau 6 tuần nuôi cấy, tăng gấp 3 lần so với nuôi cấy trên môi trường ñặc và sự tái sinh chồi từ
PLB cũng tăng gấp 3,7 lần (Cung Hoàng Phi Phượng và Nguyễn Văn Hiếu, 2007) [33]. Tiếp theo sau ñó, Phạm Thị Kim Hạnh, ðoàn Duy Thanh, Hà Thị Thúy, ðỗ Năng Vịnh (2009) ñã nghiên cứu nhân nhanh in vitro giống lan
Ngọc ñiểm ñai trâu (Rhynchostylis gigantea) trong bioreactor. Môi trường nuôi cấy là VW (1949) bổ sung vitamin và axitamin của MS (1962) với các thông số kỹ thuật, nhiệt ñộ 250C, lưu lượng không khí 0,5 lít/phút, thời gian 45 ngày, chu kỳ 4 ngày ngập, 1 ngày khô là tốt nhất ñể tăng tỷ lệ cây con (91,1%), giảm thời gian phát triển mầm 5 tuần ñồng thời kích sinh trưởng cây con in vitro. Cây con ñược cấy chuyển sang môi trường ñặc sau 3 tháng ñạt kích thước 5,8 lá; 5,2 rễ; dài lá 6,1cm, rộng lá 1,35cm.
Bùi Thị Tường Thu và Trần Văn Minh (2010) [47] ñã nghiên cứu ứng dụng công nghệ bioreactor phục vụ nhân nhanh cây Hoàng thảo (Dendrobium
iryasakult cv.Sonia) PLB ñược cắt ngang thành lớp mỏng 1mm làm nguyên liệu nuôi cấy tạo mô sẹo trên môi trường MS + 0,5mg/l 2,4D + 30% CW. Thể tích dịch tế bào ñưa vào nuôi cấy trong bioreactor là 20% mô sẹo ñược nuôi cấy trên môi trường phát sinh phôi là MS+0,2mg/lBA+0,2mg/lNAẠ Chồi ñược nuôi cấy tăng cường trên bioreactor bán chìm nổi nhịp ñiệu chìm nổi là 1 phút chìm/4 giờ nổị Nhiệt ñộ, cường ñộ ánh sáng và tốc ñộ cánh khuấy thích hợp nuôi cấy trong bioreactor là 26±20C, 11,1-22,2µmol/m2/s và 30rpm. Các tác giả ñã xây dựng ñược hệ thống nhân nhanh hoa lan Hoàng Thảo với hiệu suất 6.200 chồi trên một lít dịch huyền phù tế bào phôị
Tóm lại, ở nước ta việc nghiên cứu và ứng dụng hệ thống bioreator ñể nhân giống cây trồng là còn ít và mới mẻ. Các nghiên cứu mới chỉ ñược thực hiện trong thời gian gần ñây ở Việt Nam trên một số ñối tượng kể trên và chưa có cơ quan nào thực nghiên cứu trên ñối tượng là 02 loài lan
Dendrobium nobile Lindl. và Dendrobium chrysanthum Lindl.
* Những nghiên cứu ngoài nước về vi nhân giống lan trong bioreactor
ñược ứng dụng ñể sản xuất phôi vô tính với 9 loài, nhân protocorm ñối với 1 loài hoa lan, nhân chồi và cụm chồi, tạo cây hoàn chỉnh ñối với 22 loài, nhân cây dạng củ ñối với 8 loàị
Việc sử dụng bioreactor giúp nhân giống lan trên quy mô lớn ñã ñược nghiên cứu (Park et al., 2000). Park và cộng sự ñã thành công trong nhân PLB từ mô lá Hồ ðiệp trong bioreactor bán chìm nổi thu nhận 18.000 PLB từ 20g PLB cắt mỏng ban ñầu trong môi trường Hyponex có bổ sung than hoạt tính sau 8 tuần nuôi cấy và phương pháp này có thể áp dụng cho các loài lan khác, làm giảm ñáng kể chi phí sản xuất, chi phí lao ñộng, chi phí năng lượng. Tương tự Liu và cộng sự (2001) ñã thành công khi nhân PLB Dotitaenopsis trong bioreactor bán chìm nổị Wu và cộng sự (2007) ñã xây dựng một kỹ thuật nuôi cấy 2 bước ñơn giản nhân giống Anoectochilus formosanus (là một loài lan dược liệu thu hái thân lá rễ ngoài tự nhiên) trong bioreactor 3 lít hình cầu sục khí có môi trường 0,75 lít Hyponex, 2g/l peptone và 0,5g/l than hoạt tính cho sinh trưởng chồi và rễ (Russell GẸ, 988) [93].