1.2.1. Quá trình oxy hĩa.
Quá trình oxy hĩa là một loại phản ứng hĩa học trong đĩ electron được chuyển sang chất oxy hĩa, cĩ khả năng tạo các gốc tự do sinh ra phản ứng dây chuyền phá hủy tế bào sinh vật khi cĩ mặt của oxy.
Gốc tự do (Free radical) là phân tử chỉ cĩ một điện tử duy nhất (electron mang điện âm) hay một số lẻ điện tử.
Gốc tự do cĩ điện tích khơng cân bằng, luơn cĩ xu thế lấy điện tử từ phân tử khác và tạo ra gốc tự do mới gây ra sự rối loạn chức năng của tế bào [7]. Chính do chứa điện tử độc thân mà gốc tự do cĩ hoạt tính rất mạnh, nĩ luơn sẵn sàng thực hiện oxy hố, nhận điện tử của chất mà nĩ tiếp xúc để ghép đơi với điện tử độc thân của nĩ và làm phá hủy chất bị nĩ ơxy hố. Gốc tự do ảnh hưởng lên sức khỏe con người chủ yếu theo 3 con đường: thích nghi với hệ thống chống oxy hĩa, gây tổn thương tế bào sống và làm chết tế bào sống trong cơ thể người. Trong đĩ cơ chế làm chết tế bào sống cĩ thể là làm hoại tử hoặc làm chết tế bào sống một cách hệ thống. Những gốc như superoxide, hydroxyl, peroxyl, hydroperoxyl, nitric oxide và nitrogen dioxide được coi là gốc tự do [8].
Năm 1954, bác sĩ Denham Harman thuộc Đại học Berkeley, California [15], là khoa học gia đầu tiên nhận ra sự hiện hữu của gốc tự do trong cơ thể với nguy cơ gây ra những tổn thương cho tế bào. Trước đĩ, người ta cho rằng gốc tự do này chỉ cĩ ở ngồi cơ thể.
Nguồn gốc hình thành các gốc tự do (OH., O22-., NO.,…) như tia UV, bức xạ ion hĩa, ơ nhiễm khơng khí, hút thuốc, trao đổi chất, sự cháy, căng thẳng,… Các gốc tự do là nguyên nhân gây tổn thương tế bào, protein, axit nucleic, DNA,… và
dẫn tới các căn bệnh nguy hiểm như ung thư, lão hĩa, tiểu đường, tim mạch… Do đĩ, để tránh sự gây hại của các gốc tự do thì cần thiết phải loại bỏ chúng bằng cách sử dụng các chất chống oxy hĩa bổ sung như các VTM A, VTMC, VTM E, polyphenols, flavonoids, anthocyanins, carotenoids,…
Hình.1.8. Sự hình thành các gốc tự do.
Theo các nhà nghiên cứu, gốc tự do hủy hoại tế bào theo diễn tiến sau đây: Trước hết, gốc tự do oxy hĩa màng tế bào, gây trở ngại trong việc thải chất bã và tiếp nhận thực phẩm, dưỡng khí. Tiếp theo, gốc tự do tấn cơng các ty thể, phá vỡ nguồn cung cấp năng lượng. Sau cùng, bằng cách oxy hĩa, gốc tự do làm suy yếu kích thích tố, enzyme khiến cơ thể khơng tăng trưởng được.
Theo các nhà khoa học thì gốc tự do cĩ thể là thủ phạm gây ra tới trên 60 bệnh, đáng kể nhất gồm cĩ: bệnh xơ vữa động mạch, ung thư, Alzheimer, Parkinson, đục thuỷ tinh thể, bệnh tiểu đường, cao huyết áp khơng nguyên nhân, xơ gan.
Tuy nhiên, khơng phải là gốc tự do nào cũng phá hoại. Đơi khi chúng cũng cĩ một vài tác dụng hữu ích. Nếu được kiềm chế, nĩ là nguồn cung cấp năng lượng cho cơ thể, tạo ra chất màu melanine cần cho thị giác, gĩp phần sản xuất prostaglandins cĩ cơng dụng ngừa nhiễm trùng, tăng cường tính miễn dịch, tạo thuận lợi cho sự truyền đạt tín hiệu thần kinh, co bĩp cơ thịt.
Trong cơ thể cĩ rất nhiều loại gốc tự do, mà các gốc nguy hiểm hơn cả là superoxide, ozone, hydrogen peroxide, lipid peroxy nhất là hydroxyl radical, một gốc rất dễ tham gia các phản ứng và gây ra nhiều tổn thương.
Khĩi thuốc
1.2.2. Chất chống oxy hĩa.
Khái niệm:
Chất chống oxy hĩa hợp chất cĩ tác dụng ngăn chặn hoặc làm chậm quá trình oxi hĩa chất khác.
Sự oxy hĩa là loại phản ứng hĩa học trong đĩ electron được chuyển sang chất oxy hĩa, cĩ khả năng tạo các gốc tự do sinh ra phản ứng dây chuyền phá hủy tế bào sinh vật. Chất chống oxy hĩa ngăn quá trình phá hủy này bằng cách khử đi các gốc tự do, kìm hãm sự oxy hĩa bằng cách oxy hĩa chính chúng. Chính vì vậy người ta hay dùng các chất khử như thiol, polyphenol thường được dùng làm chất chống oxy hĩa [11].
Sự khử gốc tự do của chất chống oxy hĩa, trong đĩ các electron khơng ghép đơi của gốc tự do sẽ được nhận electron của chất chống ơxi hĩa để tạo thành các electron ghép đơi bền vững.
Hình 1.9. Cơ chết hoạt động của chất chống oxy hĩa [17].
Chất chống oxy hĩa cũng cĩ thể gián tiếp tạo phức với các ion kim loại chuyển tiếp thường phản ứng Fenton hoặc ức chế các enzym xúc tác cho các quá trình sinh ra gốc tự do nhằm ngăn cản sự hình thành gốc tự do trong cơ thể.
Chất chống oxy hĩa đưa ra một electron, khi một phân tử gốc tự do nhận thêm một electron từ một phân tử chất chống oxy hĩa, các gốc tự do trở nên ổn định và khơng cịn khả năng gây hại.
Vai trị của chất chống oxy hĩa trong cơ thể con người Gốc tự do Chất chống oxy hĩa
Điện tử chưa ghép đơi Nhường electron
Chất chống oxy hĩa cĩ vai trị quan trọng đối với sức khỏe con người, nhờ vào khả năng ngăn chặn sự tấn cơng của gốc tự do lên tế bào nên các tế bào trong cơ thể khơng bị hủy hoại, gĩp phần bảo vệ sức khỏe con người, ngăn chặn được nhiều căn bệnh nguy hiểm cĩ sự tham gia của gốc tự do (tim mạch, xương khớp, đái tháo đường, đục thủy tinh thể, ung thư...). Chất chống oxy hĩa gĩp phần ngăn chặn sự lão hĩa của cơ thể, làm đẹp da, do đĩ chúng ngày càng được ứng dụng rộng rãi trong cơng nghiệp mỹ phẩm.
1.2.3. Đặc điểm các nhĩm hợp chất sinh học cĩ trong hải miên
Theo kết quả phân tích hoạt tính chống oxy hĩa của 23 lồi hải miên được lấy mẫu ở vùng biển Việt Nam từ Quảng Ninh đến Phú Quốc cho thấy tất cả các lồi hải miên phân tích đều cĩ hoạt tính chống oxy hĩa và trong thành phần cĩ chứa các nhĩm hợp chất polypeptide, saponin, sterol, flavonoid, glycoside và polyphenol, đây đều là những nhĩm hợp chất cĩ hoạt hoạt tính chống oxy hĩa. Trong đĩ, polypeptide và polyphenol là những hợp chất cĩ hoạt tính chống oxy hĩa cao và được ứng dụng rộng rãi trong sản xuất thực phẩm chức năng, mỹ phẩm và dược phẩm.
1.2.3.1. Nhĩm hợp chất phenol
Các hợp chất phenol là nhĩm hợp chất hữu cơ cĩ chứa một hay nhiều nhĩm hydroxyl (-OH) gắn với một hay nhiều vịng thơm. Cấu trúc của chúng tương tự các hợp chất dạng rượu nhưng lớp phenol cĩ các thuộc tính duy nhất chỉ chúng cĩ (do nhĩm hydroxyl khơng liên kết với nguyên tử cacbon no). Trong cấu trúc của chúng, vịng thơm kết hợp mạnh với nguyên tử oxy và liên kết tương đối lỏng lẻo giữa nguyên tử oxy này với nguyên tử hydro trong nhĩm hydroxyl do đĩ dễ tách nguyên tử hydro ra khỏi nhĩm nên chúng cĩ tính acid tương đối cao. Một số polyphenol thực vật tiêu biểu như catechine, flavanone, anthocyanidin, flavones, flavonol, isoflavone, acid hydroxycinnamic, lignin, tachin. Polyphenol là những hợp chất phân cực nên thường dùng các dung mơi phân cực để chiết tách chúng ra khỏi nguyên liệu, các dung mơi thường dùng để tách chiết như nước cất, ethanol, methanol,… Trong đĩ, dung mơi được sử dụng phổ biến là nước cất và ethanol do tính an tồn, cĩ khả năng hịa tan tốt các polyphenol, cũng như giá thành rẻ.
1.2.3.2. Nhĩm hợp chất sterol
Sterol là rượu đa vịng, no đơn chức và là dẫn xuất của steran. Các sterol là các chất kết tinh, dễ tan trong cloroform, ete, rượu nĩng…, khơng tan trong nước. Đặc tính của sterol là khơng phân cực, nên rất kém tan trong nước nhưng tan trong dầu béo và các dung mơi hữu cơ khơng phân cực như ete, dầu hỏa, benzen, cloroform, aceton,… nên thường dùng các dung mơi này để chiết sterol ra khỏi nguyên liệu. Đối với các sterol glycoside cĩ thể chiết bằng ethanol. Sản phẩm chiết bằng dung mơi hữu cơ thường là hỗn hợp của sterol và các chất béo, các chất kém phân cực khác cĩ trong nguyên liệu như lipid (đối với sterol động vật), caroten, leucithin (đối với sterol thực vật). Phải thực hiện phản ứng xà phịng hĩa để tách các chất này ra khỏi sterol, sau đĩ chiết sterol bằng dung mơi hữu cơ. Thực hiện sắc ký (cột, lớp mỏng, giấy,...) để phân lập hoặc kết tinh phân đoạn, tinh chế sterol.
1.2.3.3. Nhĩm hợp chất flavonoid
Flavonoid là một nhĩm hợp chất tự nhiên lớn thường gặp trong thực vật, cĩ ở phần lớn các bộ phận của các loại thực vật bậc cao. Flavonoid cĩ khung cơ bản là C6-C3-C6 gồm 2 vịng benzen A và B nối với nhau qua một mạch 3 cacbon, cấu trúc cĩ thể là vịng kín hoặc mở. Trong thực vật, flavonoid tồn tại chủ yếu ở hai dạng: dạng tự do (aglycol) và dạng liên kết với đường (glycoside). Trong đĩ, dạng aglycol thường tan trong các dung mơi hữu cơ như ete, aceton, cồn nhưng hầu như khơng tan trong nước, cịn dạng glycoside thì tan trong nước nhưng khơng tan trong các dung mơi khơng phân cực như aceton, benzen, chloroform.
1.2.3.4. Nhĩm hợp chất saponin
Saponin là hợp chất hữu cơ được cấu tạo gồm phần đường (glucose, galactose, pentose, metyl pentose,...) và phần sapogenin (aglycol). Phân sapogenin cĩ thể là steroid hay triterpenoid. Saponin cĩ tính chất chung là khi hồ tan vào nước cĩ tác dụng làm giảm sức căng bề mặt của dung dịch tạo nhiều bọt, cĩ tính chất phá huyết, độc đối với động vật máu lạnh nhất là đối với cá, tạo thành phức với cholesterol, cĩ vị hắc và làm hắt hơi mạnh. Thường các steroid saponin thì tả truyền cịn triterpenoid saponin thì hữu truyền. Điểm nĩng chảy của các sapogenin thường
rất cao. Saponin là hợp chất phân cực nên thường sử dụng các dung mơi phân cực để chiết xuất saponin.
1.2.3.5. Nhĩm hợp chất polypeptide
Polypeptide là hợp chất hữu cơ được cấu tạo từ các acid amin liên kết với nhau bằng liên peptide. Khác với protein, polypeptide cĩ khối lượng phân tử dưới 10.000 Da trong khi protein cĩ khối lượng phân tử lớn hơn.
Nhiều nghiên cứu chứng minh rằng các polypeptide cĩ hoạt tính chống oxy hĩa in vitro như khử các gốc tự do diphenyl-1-picryhydradzyl (DPPH), superoxide, hydroxyl, tạo phức càng với ion kim loại, khử sắt và chống oxy hĩa acid linoleic (Elias và cộng sự, 2008). Đặc tính chống oxy hĩa của polypeptide phụ thuộc vào cấu trúc, thành phần acid amin và khối lượng phân tử của peptide (Tang và cộng sự, 2009; Udenigwe và Aluko, 2011). Nước và các dung mơi phân cực hịa tan tốt polypeptide nên chúng được sử dụng để chiết xuất peptide.
1.2.3.6. Nhĩm hợp chất glycoside
Glycoside là hợp chất hữu cơ được cấu tạo gồm phần đường (glucose, ramnose, digitoxose, xymarose,...) và phần aglycol (steroid, sterol, acid mật, hormon,...). Tùy theo đặc điểm cấu tạo của aglycol mà glycoside cĩ hoạt tính sinh học khác nhau. Hoạt tính chống oxy hĩa của glycoside khác nhau phụ thuộc vào độ hịa tan và sự oxy hĩa aglycon chứa monosaccharide hoặc disaccharide ở vị trí C3. Glycoside là hợp chất phân cực nên hịa được trong các dung mơi phân cực như nước cất, methanol, ethanol,... Vì vậy, để chiết xuất glycoside thường sử dụng các dung mơi phân cực.
1.2.3.7. Protein
Protein là đại các phân tử cĩ số lượng lớn trong tất cả các loại tế bào và các bào quan. Protein rất đa dạng, cĩ hàng nghìn loại với kích thước khác nhau, từ những peptide nhỏ đến những đại phân tử với khối lượng phân tử lớn.
Để thu được protein trước tiên phải phá vỡ cấu trúc tế bào, thơng thường nên cắt nhỏ để cắt bỏ các mơ liên kết.
yếu tố vật lý và hĩa học khác nhau như sử dụng song siêu âm, dùng các dung mơi hữa cơ.
Dưới tác dụng của các tác nhân vật lý như tia cực tím, sĩng siêu âm, khuấy cơ học... hay tác nhân hĩa học như axit, kiềm mạnh, muối kim loại nặng,... các cấu trúc bậc hai, bậc ba và bậc bốn của protein bị biến đổi nhưng khơng phá vỡ cấu trúc bậc một của nĩ, kèm theo đĩ là sự thay đổi làm biến tính protein.
1.2.4. Các phương pháp phân tích hoạt tính chống oxy hĩa
Cĩ nhiều phương pháp phân tích hoạt tính chống oxy hĩa như: phương pháp
phân tích hoạt tính chống oxy hĩa dựa vào khả năng khử gốc tự do DPPH, phương pháp phân tích hoạt tính chống oxy hĩa dựa vào tổng năng lực khử, phương pháp phân tích hoạt tính chống oxy hĩa dựa vào khả năng khử hydroperoxide, phương pháp phospho molebdenum… Trong đĩ hai phương pháp phân tích được áp dụng phổ biến nhất là phương pháp phân tích khử gốc tự do DPPH và phương pháp phân tích tổng năng lực khử.
1.2.4.1. Phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxy hĩa dựa vào khả năng khử gốc tự do DPPHl,l-diphenyl-2-picrylhydrazyl gốc tự do DPPHl,l-diphenyl-2-picrylhydrazyl
DPPH là phương pháp được sử dụng rộng rãi để sàng lọc các chất chống oxy hĩa vì nĩ đơn giản, nhanh chĩng và ổn định.
Nguyên lý của phương pháp:
DPPH là một gốc tự do bền, cĩ màu tím nhờ vào điện tử N chưa ghép đơi và cĩ độ hấp thụ cực đại ở bước sĩng 517nm. Khi cĩ mặt chất chống oxy hĩa, nĩ sẽ bị khử thành 2,2-diphenyl-l- picrylhydrazyl (DPPH- H) do trung hịa gốc DPPH bằng cách cho đi nguyên tử hydro, dung dịch phản ứng sẽ nhạt dần chuyển từ tím sang vàng nhạt. Nghĩa là các gốc tự do DPPH đã kết hợp với một nguyên tử hydro của chất chống oxy hĩa để tạo thành DPPH dạng nguyên tử. Hoạt tính khử gốc tự do của chất chống oxy hĩa tỉ lệ thuận với độ mất màu của DPPH.
Đo độ giảm hấp thụ ở bước sĩng 517 nm để xác định khả năng khử gốc DPPH của chất chống oxy hĩa.
1.2.4.2. Phương pháp phân tích hoạt tính chống oxy hĩa dựa vào tổng năng lực khử
Nguyên lý của phương pháp:
Tổng năng lực khử của một chất là khả năng chất đĩ cho điện tử khi tham gia phản ứng oxy hĩa khử. Do đĩ, tổng năng lực khử cũng biểu hiện khả năng chống oxy hĩa của một chất. Trong đĩ, chất khử (chất cĩ hoạt tính chống oxy hĩa) sẽ khử potassium ferricyanid (K3[Fe(CN)6]) thành potassium ferrocyanid (K4[Fe(CN)6]). Ion Fe3+ trong phân tử potassium ferricyanid bị khử thành ion Fe2+ trong phân tử potassium ferrocyanid.
Khi bổ sung Fe3+ Fe3+ sẽ phản ứng với ion ferrocyanid tạo thành một phức
họp ferric ferrocyanid màu xanh dương cĩ cơng thức (K4[Fe(CN)6]). Phức họp này
cĩ độ hấp thụ cực đại ở bước sĩng 700nm.
4Fe3+ + 3 [Fe(CN)6]4+ → K4[Fe(CN)6] (màu xanh)
Cường độ màu tỉ lệ thuận với hàm lượng ion ferrocyanid được tạo thành. Do đĩ cường độ màu càng cao chứng tỏ tổng năng lực khử của mẫu khử càng cao.
Đo độ hấp thụ ở bước sĩng 700 nm để xác định tổng năng lực khử của chất chống oxy hĩa.
1.3. Các phương pháp tách chiết xuất các hợp chất tự nhiên cĩ hoạt tính sinh học từ hải miên.
1.3.1. Nguyên lý
Chiết xuất là phương pháp sử dụng dung mơi để lấy các chất tan ra khỏi các mơ nguyên liệu mà vẫn giữ được thành phần và bản chất của nĩ. Khi cho nguyên liệu và dung mơi tiếp xúc với nhau, lúc đầu dung mơi thấm vào nguyên liệu, sau đĩ những chất tan trong nguyên liệu hồ tan vào dung mơi, rồi được khuếch tán ra ngồi. Kết thúc quá trình chiết sẽ thu được dung dịch của các chất hịa tan trong dung mơi. Dung dịch này được gọi là dịch chiết. Việc lựa chọn dung mơi để chiết xuất phụ thuộc vào thành phần và bản chất của nguyên liệu.
Quá trình chính trong chiết xuất là sự khuếch tán. Về lý thuyết khuếch tán,
người ta nghiên cứu hai quá trình là quá trình khuếch tán phân tử và quá trình khuếch tán đối lưu. Trong lớp màng, quá trình di chuyển vật chất cơ bản là nhờ sự tiếp xúc giữa các phân tử và sự tác dụng tương hỗ giữa chúng, do đĩ quá trình khuếch tán qua màng được gọi là quá trình khuếch tán phân tử. Trong nhân của dịng, quá trình di chuyển vật chất nhờ vào sự xáo trộn các phần tử của dịng, vì thế gọi là khuếch tán đối lưu. Khuếch tán phân tử là sự di chuyển lẫn nhau giữ các