Để kiểm tra xem đoạn gen chèn vào vector pET22trx có đúng là ha5-1 hay không, chúng tôi tiến hành cắt kiểm tra plasmid tái tổ hợp bằng cặp enzyme cắt giới hạn NcoI và BamHI. Vector pET22trx cũng được xử lý bằng cặp enzyme này để làm đối chứng.
Theo lý thuyết, vector pET22trx có kích thước 5904 bp, mang trình tự nhận biết của hai enzyme NcoIvà BamHIở cách nhau 14 bp. Do đó, khi xử lí vector này
Hình 3.2: Phân tích sản phẩm tách chiết DNA plasmid trên gel agarose 0,8%. 1-4: Plasmid tái tổ
hợp pET22Trxha1; 5: Plasmid đối chứng (pET22Trx)
pET22Trxha5-1
1 2 3 4 5
35
1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 M
với hai enzyme cắt hạn chế sẽ thu được hai đoạn DNA có kích thước tương ứng là 5,9 kb và 14 bp. Enzyme NcoI và BamHInằm ở đầu gen ha5-1 nên khi cắt bằng cặp enzyme này sẽ giải phóng ra đoạn gen ha5-1 có kích thước xấp xỉ 1 kb và vector pET22Trx có kích thước 5,9 kb.
Quan sát kết quả điện di (Hình 3.3) chúng tôi thấy trên các đường chạy từ số 2 đến số 5 tương ứng với sản phẩm cắt của dòng plasmid tái tổ hợp xuất hiện hai băng DNA có kích thước tương ứng khoảng 1 kb và 5,9 kb. Ngoài ra, trên điện di đồ còn thấy có 1 băng kích thước lớn hơn 5,9 kb. Dòng đối chứng khi cắt bằng 2 enzyme chỉ tạo ra đoạn DNA có kích thước tương đương 5,9 kb đúng như tính toán lý thuyết. Như vậy có thể nói đoạn DNA kích thước lớn hơn 5,9 kb xuất hiện trong sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp là do plasmid được cắt không hoàn toàn. Đoạn DNA kích thước 1 kb tương ứng với kích thước gen ha5-l được cắt ra khỏi vector và đoạn gen kích thước 5,9 kb là vector.
Để khẳng định chính xác hơn, gen ha5-l trong plasmid pET22trx đã được giải trình tự. Kết quả gen đã được tách dòng tương đồng 100% với đoạn gen mã hóa tiểu phần HA1 trên ngân hàng gen, mã số AJ867074. Như vậy vector pET22Trxha5-1 đã được thiết kế thành công.
5,9 kb
pET22Trx
Ha5-1 1 kb
Hình 3.3: Phân tích sản phẩm cắt kiểm tra plasmid tái tổ hợp (pET22Trxha5-1) bằng enzym cắt
giới hạn NcoI và BamHI . 1: plasmid pET22Trx (Đối chứng) ; 2-5: các dòng plasmid tái tổ hợp; M: Thang ADN chuẩn 1Kb (Fermentas).
1 2 3 4 5 M
36