Cơ sở lý thuyết
Điện di là một quá trình dịch chuyển của các phân tử tích điện qua mạng lưới dưới tác dụng của một điện trường. Các phân tử di chuyển với tốc độ khác nhau tùy thuộc vào điện tích, hình dạng và kích thước của phân tử.
Trong phương pháp điện di trên gel polyacrylamide-SDS (SDS-PAGE), sự di chuyển của các protein khác nhau được phân biệt dựa vào khối lượng phân tử của chúng. SDS là một chất tích điện âm có khả năng gây biến tính protein và làm âm hóa protein bằng cách bao bọc xung quanh chuỗi polypeptide. Chính vì vậy, protein sẽ trở thành dạng thẳng và có điện tích âm, kích thước của protein tùy thuộc vào số lượng các gốc amino acid của nó. Trong trường hợp này, tốc độ di chuyển của các protein trong điện trường chỉ phụ thuộc vào khối lượng của chúng.
Quy trình
Điện di biến tính trên gel polyacrylamide
- Xử lý mẫu protein: Sau khi nuôi cấy ở điều kiện cảm ứng, các tế bào được thu lại và phá vỡ bằng 50 µl đệm xử lý mẫu. Ủ hỗn hợp ở 100°C trong 10 phút để phá tế bào. Ly tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút, thu dịch nổi dùng cho điện di
26
polyacrylamide.
- Lắp bản gel, tra mẫu vào các giếng và chạy với cường độ dòng 15 mA đến khi mẫu vào tới gel tách, sau đó tăng cường độ dòng điện lên 30 - 40 mA trong khoảng 45 phút.
- Gỡ bản gel và đem nhuộm bằng Coomassie brilliant blue.
Nhuộm Coomassie Brilliant Blue
- Bản gel được rửa qua bằng nước, sau đó rửa vào dung dịch rửa 1 trong khoảng 30 phút, sau đó gel được chuyển vào dung dịch nhuộm và lắc nhẹ trong thời gian ít nhất là 1 giờ.
- Chuyển gel vào dung dịch rửa (5 ml methanol, 7.5 ml acetic acid và thêm tới 100 ml với nước khử ion). Rửa cho đến khi quan sát được băng protein.