Gen ha5-1 đã được tách dòng trong vector pCR2.1 và được gọi là pCRha5-1. Trong quá trình thiết kế mồi để tách dòng gen, phòng Kỹ thuật di truyền đã đưa trình tự nhận biết của 2 enzyme cắt giới hạn NcoI và BamHI vào hai đầu của gen
ha5-1, nên việc sử dụng chính hai enzyme này có thể thu đoạn gen ha5-1 từ vector tách dòng pCRha5-1 mà không ảnh hưởng đến trình tự của gen. Gen được đưa vào vector bằng cặp enzyme này sẽ đảm bảo gen được gắn xuôi chiều promoter và đúng khung đọc. Vector pET22trx được xử lý bằng các enzyme tương ứng để tạo đầu dính tương thích. Khi nằm trong hỗn hợp phản ứng lai ghép, các đầu dính có trình tự bổ sung sẽ bắt cặp với nhau và enzyme T4 DNA ligase sẽ tham gia xúc tác cho phản ứng hình thành liên kết phosphodiester giữa hai nucleotide đứng cạnh nhau tạo thành vector hoàn chỉnh đóng vòng. Phản ứng lai ghép này được thực hiện ở 16°C trong 3giờ.
Sản phẩm lai được biến nạp vào tế bào E. coli DH5α bằng phương pháp sốc nhiệt và được nuôi cấy trên đĩa thạch chứa môi trường LBA. Kết quả, sau khi nuôi cấy qua đêm ở 37oC, rất nhiều khuẩn lạc đã mọc lên chứng tỏ hiệu quả biến nạp tốt. Trên đĩa môi trường chọn lọc có ampicillin, chỉ những tế bào vi khuẩn E. coli mang các dòng plasmid chứa gen kháng kháng sinh mới có thể sống sót và sinh trưởng trên đĩa thạch. Như vậy, những khuẩn lạc quan sát thấy trên đĩa thạch là những dòng tế bào mang plasmid tái tổ hợp.
Trong sản phẩm vector cắt bằng NcoI và BamHI có thể vẫn còn vector chỉ được cắt bằng 1 enzyme hạn chế. Vì vector pET22trx có kích thước lớn và đoạn DNA giới hạn bởi NcoI và BamHI trong vùng đa nối bị cắt bỏ khỏi vector quá nhỏ nên không thể phân tách được vector đã được cắt hoàn toàn bằng hai enzyme cũng như sản phẩm vector mới chỉ được cắt bởi một enzyme. Do đó, sản phẩm của phản ứng lai ghép sẽ gồm cả vector tái tổ hợp mang gen ngoại lai ha5-l và vector pET22trx tự đóng vòng không mang gen ngoại lai. Để loại trừ các dòng plasmid
34
không mong muốn và lựa chọn các dòng tái tổ hợp, chúng tôi đã tiến hành tách plasmid từ các thể biến nạp để kiểm tra.
Trong 4 dòng plasmid chúng tôi đã tách chiết thì toàn bộ 4 dòng đều có kích thước lớn hơn vector pET22trx (Hình 3.2).
Vì plasmid tái tổ hợp mang gen ngoại lai nên plasmid pET22trxha5-l có kích thước lớn hơn vector pET22trx. Theo lý thuyết thì plasmid pET22Trx di chuyển nhanh hơn plasmid tái tổ hợp pET22Trxha5-1 trên gel agarose. Như vậy, các dòng plasmid đã được kiểm tra ở trên có mang gen ngoại lai. Tuy nhiên, để khẳng định gen ngoại lai này có phải là ha5-l không thì chúng tôi tiến hành cắt dòng plasmid này với các enzyme cắt giới hạn.