Nhiệt độ thường có ảnh hưởng rất lớn đối với quá trình sinh tổng hợp và hình thành cấu trúc của protein tái tổ hợp.
Trong thí nghiệm này, để khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ với quá trình tổng hợp protein TrxHA5-1, chúng tôi tiến hành nuôi cấy cảm ứng ở nhiệt độ 22°C, 28°C, 30°C, 37°C. Sau 4 giờ nuôi cấy cảm ứng, tế bào được thu lại và kiểm tra mức độ biểu hiện của protein bằng cách điện di trên gel polyacrylamide 12% có SDS. Kết quả được trình bày như ở hình 3.6.
Quan sát kết quả điện di kiểm tra, ta thấy lượng protein tái tổ hợp TrxHA5-l được tổng hợp ở nhiệt độ khác nhau là khác nhau, trong đó, băng protein TrxHA5-l biểu hiện đậm nhất ở 30°C. Như vậy ở 30o
C protein ngoại lai được tổng hợp nhiều nhất. Với kết quả này, chúng tôi lựa chọn 30°C cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.3.2. Ảnh hƣởng của nồng độ IPTG đến sự biểu hiện của gen ha5-l
IPTG là chất cảm ứng đắt tiền và ở nồng độ cao có thể gây độc cho tế bào, trong khi ở nồng độ thấp protein ngoại lai thường được tổng hợp kém. Vì thế, để lựa chọn nồng độ IPTG thích hợp nhất cho quá trình nuôi cấy với mục đích thu được
5,9 kb
Hình 3.6: Protein tổng số từ chủng tái tổ hợp E. coli BL21 mang vector pET22Trxha5-1 được cảm ứng bằng 0,5 mM IPTG ở các nhiệt độ khác nhau; 1-4 : Nhiệt độ cảm ứng tương ứng 22oC, 28oC, 30oC, 37oC; 5:Thang protein chuẩn (Fermentas)
kDa 116 66 45 35 25 18.4 14.4 TrxHA5-1 1 2 3 4 5
39
1 2 3 4 5 6
1 2 3 4 5 6
lượng lớn protein và tiết kiệm chi phí sản xuất, chúng tôi tiến hành khảo sát khả năng biểu hiện của protein tái tổ hợp TrxHA5-l ở các nồng độ cảm ứng khác nhau (0,1; 0,5; 1,0; 1,5; và 2 mM) và protein dạng không tan được kiểm tra bằng điện di trên gel gel polyacrylamide . Kết quả (Hình 3.7) cho thấy, nồng độ IPTG ảnh hưởng không nhiều tới quá trình biểu hiện protein ngoại lai, tuy nhiên nếu ở nồng độ quá ít thì protein tái tổ hợp được tổng hợp ra với một lượng tương đối nhỏ.
Như vậy để đảm bảo thu được lượng lớn protein, đồng thời tiết kiệm chi phí sản xuất chúng tôi lựa chọn nồng độ IPTG là 0,5 mM để biểu hiện protein tái tổ hợp.
3.3.3. Lựa chọn thời điểm thu mẫu thích hợp
Thông thường, tế bào chỉ sinh trưởng đến một nồng độ nhất định rồi dừng lại. Nếu thu tế bào quá muộn, nhiều tế bào già bị chết nên hàm lượng protein tái tổ hợp trong tế bào giảm đi. Trong thí nghiệm này, chúng tôi tiến hành thu tế bào theo thời gian để kiểm tra lượng TrxHA5-1 pha không tan.
Hình 3.7: Protein tổng số từ chủng tái tổ hợp E. coli BL21 mang vector pET22Trxha5-1 được cảm ứng ở các nồng độ IPTG khác nhau; 1-5 : Nồng độ chất cảm ứng IPTG tương ứng 0,1mM, 0,5mM, 1 mM, 1,5 mM: 2 mM; 6: Thang protein chuẩn (Fermentas)
kDa 116 66 45 35 25 18.4 14.4 5,9 kb TrxHA5-1 1 2 3 4 5 6
40
Kết quả (Hình 3.8) cho thấy tế bào bắt đầu sinh tổng hợp protein ngay từ những giờ đầu và tăng dần theo thời gian (từ 0 giờ đến 3 giờ). Sau 4 giờ nuôi cấy cảm ứng, tế bào trong môi trường sinh trưởng đã đạt đến mức tối đa và đạt đến pha cân bằng. Lúc này quá trình sinh tổng hợp protein tái tổ hợp TrxHA5-1 diễn ra mạnh và gần như đạt đỉnh điểm. Như vậy, khả năng sinh tổng hợp protein tái tổ hợp TrxHA5-1 phụ thuộc vào pha sinh trưởng của tế bào. Lượng protein thu được cao nhất sau 4 giờ nuôi cấy cảm ứng .
Kết luận: từ những kết quả thu được về các điều kiện tối ưu, chúng tôi lựa chọn điều kiện nuôi cấy để đạt được lượng lớn protein tái tổ hợp ở 30°C, nồng độ chất cảm ứng là 0,5 mM và thời gian là 4 giờ sau khi nuôi cấy cảm ứng.
3.4 TINH CHẾ SƠ BỘ PROTEIN TÁI TỔ HỢP TRXHA5-1
Để kiểm tra khả năng gây đáp ứng miễn dịch của protein tái tổ hợp khi sử dụng trong mục đích chế tạo vaccine, cần phải thu được protein này ở dạng tinh sạch. Vì vậy, chúng tôi tiến hành nuôi cấy cảm ứng thu lượng lớn protein để chuẩn bị cho bước tinh chế.
Để thu được protein dạng tinh sạch, người ta thường dựa vào các đặc điểm tương đồng và các tính chất khác nhau vốn có của nó. Căn cứ vào nhiều đặc tính
Hình 3.8: Protein tổng số từ chủng tái tổ hợp E.coli BL21 mang vector pET22Trxha5-1
được cảm ứng bằng 0,5 mM IPTG ở các thời gian thu mẫu khác nhau; 1-5 : Thời gian thu mẫu sau khi cảm ứng tương ứng 1, 2, 3, 4, 5 giờ; 6: Thang protein chuẩn (Fermentas) kDa 116 66 45 35 25 18.4 14.4 TrxHA5-1 1 2 3 4 5 6
41
như sự khác nhau về hình dạng, kích thước, điện tích, tính ưa nước, khả năng tan và không tan.
Trong một số trường hợp, để dễ dàng cho việc tinh chế, người ta biểu hiện protein dưới dạng dung hợp với peptide có ái lực với ion kim ví dụ như His-tag, có ái lực với kháng thể như Myc-tag,... Trong nghiên cứu này, gen ha5-1 cũng được dung hợp với đoạn gen mã hóa cho 6 amino acid Histidine ở phía đầu N và đầu C của
HA5-1. Vì vậy, có thể dựa vào đặc tính này để tinh chế protein tái tổ hợp. Tuy nhiên, phần lớn TrxHA5-1 được tổng hợp trong E. coli dưới dạng không tan nên protein này có thể được phân tách dễ dàng với protein tan của tế bào bằng cách ly tâm thu cặn sau đó cặn chứa TrxHA5-1 được pha lại trong đệm urê 2 M và DTT 10 mM.
Quy trình tinh chế protein đã được trình bày trong phần phương pháp.
Để tinh chế protein tái tổ hợp, trước hết tế bào được phá bằng siêu âm, sau đó ly tâm loại bỏ pha tan trong nước. Để loại bỏ các protein tan trong nước khác, tủa tiếp tục được rửa lại 2 lần bằng nước và rửa bằng đệm B1, sau đó tủa được hòa tan bằng dung dịch B2 chứa urê 2 M để thu nhận TrxHA5-1. Chúng tôi đã thử nghiệm hòa tan tủa protein trong đệm urê 4 M nhưng ở trong đệm này hầu hết các protein không tan khác cũng bị tan ra và nồng độ urê 2 M là nồng độ thích hợp cho việc làm tan protein tốt nhất. Ở nồng độ này, một phần nhỏ protein không tan có lẫn trong mẫu được loại bỏ.
Hình 3.9: Điện di kiểm tra Trxha5-1 tinh chế trên gel polyacrylamide; 1- Protein tổng
số E. coli BL21 mang plasmid pETT22Trxha5-1;2-Thang protein chuẩn; 3: phân đoạn
chứa Trx-HA5-1 hòa tan trong urê 2 M.
kDa 116 66 45 35 25 18.4 14.4 1 2 3 TrxHA5-1
42
Kết quả (Hình 3.9, đường chạy 3) cho thấy protein tái tổ hợp thu được sau khi loại bỏ pha tan là khá sạch, được thể hiện một băng protein có kích thước khoảng 57,5 kDa khá đậm và sạch hơn rất nhiều so với protein ban đầu. Tuy nhiên, trong mẫu vẫn còn lẫn một số băng protein có kích thước xấp xỉ 40, 45 kDa. Các protein này có thể là protein của vi khuẩn hoặc protein do TrxHA5-1 bị phân cắt hoặc bị đứt gãy tạo ra.
Đối với protein tái tổ hợp sử dụng trong vaccine, một điểm rất quan trọng là phải có tính kháng nguyên giống với tính kháng nguyên của protein tự nhiên. Vì lý do này, protein sau khi tinh chế sẽ được tiến hành thử khả năng đáp ứng đặc hiệu với kháng thể kháng virus cúm A/H5N1 thu được từ thỏ bằng kỹ thuật Western blot.
Trong thí nghiệm này, protein tái tổ hợp TrxHA5-l được cố định trên màng PVDF, sau đó, ủ màng với kháng thể tự nhiên kháng HA5 thu được từ thỏ nhiễm virút cúm H5N1. Tiếp tục ủ màng với kháng thể cộng hợp là kháng thể nhận biết kháng thể tự nhiên kháng HA5. Ngoài ra, trên kháng thể cộng hợp còn gắn enzyme peroxidase (horse radish peroxidase- HRS). Do đó, thông qua phản ứng màu của enzyme, có thể phát hiện được phức hợp kháng nguyên và kháng thể nói trên.
Kết quả kiểm tra tính kháng nguyên của protein thể hiện trên hình 3.10
A B
Hình 3.10: Kiểm tra tính kháng nguyên của protein TrxHA5-1 tái tổ hợp; (A) Phân tích
protein trên gel điện di polyacrylamide; (B): Phân tích khả năng bắt cặp đặc hiệu của kháng nguyên tái tổ hợp với kháng thể kháng lại HA5 của virus cúm A/H5N1; 1- phân đoạn chứa TrxHA5-1 sau khi tinh chế; 2 - Thang protein chuẩn; 3 - Protein tổng số E. coli
BL21 mang plasmid pETT22Trx.
1 2 3 TrxHA5-1 kDa 116 66 35 25 18.4 14.4 kDa 116 66 45 35 25 18.4 14.4 1 2 3 TrxHA5-1
43
Quan sát trên màng PVDF, trên hình 3.10 (B) ta thấy đường chạy số 3 là protein tổng số tách chiết từ chủng vi khuẩn E. coli BL21 mang vector pET22trx không mang gen ha5-l, không thấy sự xuất hiện của băng màu có kích thước tương ứng với gen TrxHA5-l. Trong khi đó trên đường chạy số 1 xuất hiện băng protein rất rõ nét, kích thước khoảng 57,5 kDa có khả năng kết hợp đặc hiệu với kháng thể kháng virus cúm A/H5N1. Điều đó chứng tỏ kháng nguyên tái tổ hợp TrxHA5-l được tổng hợp trong E. coli với trình tự amino acid chính xác chứa các quyết định kháng nguyên nằm trên tiểu phần ha5-1.
Đúng như dự đoán ở phần trên, các protein có kích thước khoảng 45 và 40 kDa có lẫn trong sản phẩm TrxHA5-1 tinh sạch chính là sản phẩm TrxHA5-1 bị đứt gãy hoặc bị phân cắt. Vì các phần bị phân cắt vẫn còn các vùng epitope liên kết đặc hiệu với kháng thể nên khi lai Western blot, các đoạn peptide này đã liên kết khá tốt với kháng thể kháng HA.
3.5 KIỂM TRA TÍNH SINH ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH CỦA PROTEIN TÁI TỔ HỢP HA5-1 HỢP HA5-1
Một trong những yêu cầu hàng đầu của vaccine là khả năng sinh đáp ứng miễn dịch tốt. Chúng tôi đã kiểm tra khả năng sinh đáp ứng miễn dịch của protein tái tổ hợp TrxHA5-1 thông qua phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu (haemagglutination inhibition-HI) của kháng thể được sinh ra sau khi gây miễn dịch cho gà với kháng nguyên TrxHA5-1.
Protein TrxHA5-1 sau khi tinh chế được trộn với tá chất Freund dùng để tiêm, tá chất Cbt dùng để nhỏ mũi (gà 2 tuần tuổi). Lượng kháng nguyên TrxHA5-1 sử dụng để tiêm và nhỏ mũi là 100 µg. Sau khi gây miễn dịch lần 1 được 14 ngày, gà được gây miễn dịch lần 2. Huyết thanh của gà sau khi tiêm và nhỏ mũi, mắt được thu lại sau mỗi tuần trong 5 tuần.
Theo nguyên lý của phản ứng HI, nếu kháng nguyên tái tổ hợp kích thích sinh đáp ứng miễn dịch tạo ra kháng thể giống với kháng thể kháng lại HA của virus cúm trong tự nhiên thì kháng thể lấy từ gà gây miễn dịch sẽ liên kết được với
44
kháng nguyên của virus đã bị phân cắt (splited virus) làm phong bế vùng gắn với thụ thể hồng cầu gà. Do đó, khi cho tế bào hồng cầu gà vào, hồng cầu sẽ bị sa lắng dưới đáy giếng chữ U. Vì vậy, nếu kháng thể có hiệu giá càng cao thì khả năng gây sa lắng hồng cầu càng lớn, có nghĩa là càng có khả năng ngăn trở virus gây ngưng kết hồng cầu.
Kết quả trên hình 3.11 cho thấy, ở lô đối chứng, gà được gây miễn dịch với PBS đã không tạo kháng thể kháng lại TrxHA5-1, nhưng trong lô gà gây miễn dịch với chủng đối chứng, hiệu giá HI ở mức thấp. Điều này có thể giải thích là các protein của chủng đối chứng có lẽ đã gây ra đáp ứng miễn dịch làm tăng bổ thể và chính bổ thể đã có ảnh hưởng lên hiệu giá HI. Tuy nhiên, hiệu giá này rất thấp so với các lô gây miễn dịch với TrxHA5-1 nên không ảnh hưởng đến kết quả thí nghiệm.
Hiệu giá kháng thể của gà được tiêm và nhỏ mắt, mũi với TrxHA5-1 tăng dần từ tuần thứ 1 đến tuần thứ 4 và đạt giá trị lớn nhất sau 3, 4 tuần, sang tuần thứ 5 hiệu giá kháng thể ở lô tiêm giảm xuống rất nhanh trong khi ở lô nhỏ mắt, mũi hiệu giá có xu hướng giảm nhưng vẫn duy trì ở mức cao hơn so với lô tiêm. Như vậy, sơ bộ có thể thấy độ dài miễn dịch của kháng nguyên được đưa vào bằng đường nhỏ mắt, mũi tốt hơn là bằng đường tiêm.
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 PBS Dịch lên men chủng đối chứng
TrxHA1E, tiêm TrxHA1E, nhỏ
mắt mũi H iệ u g iá H I (l o g 2 ) Tuần 1 Tuần 2 Tuần 3 Tuần 4 Tuần 5
PBS Dịch lên men TrxHA5-1, tiêm TrxHA5-1, nhỏ chủng đối chứng mắt, mũi
45
KẾT LUẬN
Với các kết quả thu được ở trên, chúng tôi đi đến một số kết luận sau:
- Protein tái tổ hợp TrxHA5-l được biểu hiện tốt trong tế bào E. coli BL21 dưới sự điều kiến của promoter T7 và chất cảm ứng IPTG có trong môi trường.
- Protein tái tổ hợp TrxHA5-l được tổng hợp tốt nhất ở điều kiện lên men là 30°C, 0,5 mM IPTG và thời gian thu mẫu sau khi cảm ứng là 4 giờ.
- Protein tái tổ hợp TrxHA5-l đã được tinh chế thành công bằng siêu âm và hòa tủa trong urê 2 M.
- Protein tái tổ hợp đảm bảo tính kháng nguyên và tính sinh miễn dịch trên gà.
Tuy nhiên hiệu giá kháng thể thu được sau khi gây miễn dịch với liều 100 g TrxHA5-1 còn thấp. Hiệu giá tối đa thu được khi gây miễn dịch bằng đường tiêm là 2,7 log2, gây miễn dịch qua đường nhỏ mắt, mũi là 2,2 log 2.
46
ĐỊNH HƢỚNG NGHIÊN CỨU
Nghiên cứu liều vaccine thích hợp để thu được đáp ứng miễn dịch cao trên gà với hiệu giá HI ngang bằng với vaccine thương phẩm.
47
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt
1. Lê Thanh Hòa, Đinh Duy Kháng, Phan Văn Chi, Nông Văn Hải, Trương Nam Hải, Nguyễn Thị Bích Nga và Lê Trần Bình (2006), “Molecular characterization of the H5 gene for the highly pathogenic A/H5N1 strains isolated in Vietnam during”, 68-71. Proceedings of International Workshop on Biotechnology in Agriculture (20.10.2006). Nong Lam University Ho Chi Minh City.
Tiếng Anh
2. Aoki F.Y., Boivin G., Roberts N. (2007), “Influenza virus susceptibility and resistance to oseltamivir”, Antivir Ther 12(4B), PP. 603-616, Review.
3. Baigent S. J., McCauley J. W. (2001), “Glycosylation of haemagglutinin and stalk-length of neuraminidase combine to regulate the growth of avian influenza viruses in tissue culture”, Virus Res 79(1-2), PP 177-185.
4. Basler C. F. (2007), “Influenza viruses: basic biology and potential drug targets”, Infect Disord Drug Targets 7(4), PP 282-293, Review.
5. Bender C., Hall H., Huang J., Klimov A., Cox N., Hay A., Gregory V., Cameron K., Lim W. and Subbarao K. (1999), “Characterization of the surface proteins of influenza A (H5N1) viruses isolated from humans in 1997 – 1998”, Virology 254, pp 115-123.
6. Bosch F. X., Garten W., Klenk H. D., Rott R. (1981), “Proteolytic cleavage of influenza virus hemagglutinins; primary structure of the connecting peptide between HA1 and HA2 determines proteolytic cleavability and pathogenicity of avian influenza viruses”, Virology 113, pp 725-735.
7. Bublot M.,Pritchard N., Swayne D. E.,Selleck P.,Karaca K.,Suarez D. L., Audonnet J. C.,Mickle T. R. (2006), “Development and use of fowlpox vectored vaccines for avian influenza”. Ann N Y Acad Sci,pp 193-201.
8. Castrucci M. R., Kawaoka Y. (1993), “Biologic importance of neuraminidase stalk length in influenza A virus”, J Virol67, pp 759-764.
48
9. Chen H., Deng G., Li Z., Tian G., Li Y., Jiao P. (2004), “The evolution of H5N1 influenza viruses in ducks in southern China”, Proc Natl Acad Sci USA 101, pp 10452-10457.
10. Chen L. M., Davis C. T., Zhou H., Cox N. J., Donis R. O. (2008), “Genetic compatibility and virulence of reassortants derived from contemporary avian H5N1 and human H3N2 influenza A viruses”. PLoS Pathog 4(5), e1000072. 11. Conenello G.M., Zamarin D., Perrone L.A., Tumpey T., Palese P. (2007), “A
single mutation in the PB1-F2 of H5N1 (HK/97) and 1918 influenza A viruses contributes to increased virulence”, PLoS Pathog 3(10), pp 1414-1421.
12. Doherty P. C., Turner S. J., Webby R. G., Thomas P. G. (2006), “Influenza and