HỢP HA5-1
Một trong những yêu cầu hàng đầu của vaccine là khả năng sinh đáp ứng miễn dịch tốt. Chúng tôi đã kiểm tra khả năng sinh đáp ứng miễn dịch của protein tái tổ hợp TrxHA5-1 thông qua phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu (haemagglutination inhibition-HI) của kháng thể được sinh ra sau khi gây miễn dịch cho gà với kháng nguyên TrxHA5-1.
Protein TrxHA5-1 sau khi tinh chế được trộn với tá chất Freund dùng để tiêm, tá chất Cbt dùng để nhỏ mũi (gà 2 tuần tuổi). Lượng kháng nguyên TrxHA5-1 sử dụng để tiêm và nhỏ mũi là 100 µg. Sau khi gây miễn dịch lần 1 được 14 ngày, gà được gây miễn dịch lần 2. Huyết thanh của gà sau khi tiêm và nhỏ mũi, mắt được thu lại sau mỗi tuần trong 5 tuần.
Theo nguyên lý của phản ứng HI, nếu kháng nguyên tái tổ hợp kích thích sinh đáp ứng miễn dịch tạo ra kháng thể giống với kháng thể kháng lại HA của virus cúm trong tự nhiên thì kháng thể lấy từ gà gây miễn dịch sẽ liên kết được với
44
kháng nguyên của virus đã bị phân cắt (splited virus) làm phong bế vùng gắn với thụ thể hồng cầu gà. Do đó, khi cho tế bào hồng cầu gà vào, hồng cầu sẽ bị sa lắng dưới đáy giếng chữ U. Vì vậy, nếu kháng thể có hiệu giá càng cao thì khả năng gây sa lắng hồng cầu càng lớn, có nghĩa là càng có khả năng ngăn trở virus gây ngưng kết hồng cầu.
Kết quả trên hình 3.11 cho thấy, ở lô đối chứng, gà được gây miễn dịch với PBS đã không tạo kháng thể kháng lại TrxHA5-1, nhưng trong lô gà gây miễn dịch với chủng đối chứng, hiệu giá HI ở mức thấp. Điều này có thể giải thích là các protein của chủng đối chứng có lẽ đã gây ra đáp ứng miễn dịch làm tăng bổ thể và chính bổ thể đã có ảnh hưởng lên hiệu giá HI. Tuy nhiên, hiệu giá này rất thấp so với các lô gây miễn dịch với TrxHA5-1 nên không ảnh hưởng đến kết quả thí nghiệm.
Hiệu giá kháng thể của gà được tiêm và nhỏ mắt, mũi với TrxHA5-1 tăng dần từ tuần thứ 1 đến tuần thứ 4 và đạt giá trị lớn nhất sau 3, 4 tuần, sang tuần thứ 5 hiệu giá kháng thể ở lô tiêm giảm xuống rất nhanh trong khi ở lô nhỏ mắt, mũi hiệu giá có xu hướng giảm nhưng vẫn duy trì ở mức cao hơn so với lô tiêm. Như vậy, sơ bộ có thể thấy độ dài miễn dịch của kháng nguyên được đưa vào bằng đường nhỏ mắt, mũi tốt hơn là bằng đường tiêm.
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 PBS Dịch lên men chủng đối chứng
TrxHA1E, tiêm TrxHA1E, nhỏ
mắt mũi H iệ u g iá H I (l o g 2 ) Tuần 1 Tuần 2 Tuần 3 Tuần 4 Tuần 5
PBS Dịch lên men TrxHA5-1, tiêm TrxHA5-1, nhỏ chủng đối chứng mắt, mũi
45
KẾT LUẬN
Với các kết quả thu được ở trên, chúng tôi đi đến một số kết luận sau:
- Protein tái tổ hợp TrxHA5-l được biểu hiện tốt trong tế bào E. coli BL21 dưới sự điều kiến của promoter T7 và chất cảm ứng IPTG có trong môi trường.
- Protein tái tổ hợp TrxHA5-l được tổng hợp tốt nhất ở điều kiện lên men là 30°C, 0,5 mM IPTG và thời gian thu mẫu sau khi cảm ứng là 4 giờ.
- Protein tái tổ hợp TrxHA5-l đã được tinh chế thành công bằng siêu âm và hòa tủa trong urê 2 M.
- Protein tái tổ hợp đảm bảo tính kháng nguyên và tính sinh miễn dịch trên gà.
Tuy nhiên hiệu giá kháng thể thu được sau khi gây miễn dịch với liều 100 g TrxHA5-1 còn thấp. Hiệu giá tối đa thu được khi gây miễn dịch bằng đường tiêm là 2,7 log2, gây miễn dịch qua đường nhỏ mắt, mũi là 2,2 log 2.
46
ĐỊNH HƢỚNG NGHIÊN CỨU
Nghiên cứu liều vaccine thích hợp để thu được đáp ứng miễn dịch cao trên gà với hiệu giá HI ngang bằng với vaccine thương phẩm.
47
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt
1. Lê Thanh Hòa, Đinh Duy Kháng, Phan Văn Chi, Nông Văn Hải, Trương Nam Hải, Nguyễn Thị Bích Nga và Lê Trần Bình (2006), “Molecular characterization of the H5 gene for the highly pathogenic A/H5N1 strains isolated in Vietnam during”, 68-71. Proceedings of International Workshop on Biotechnology in Agriculture (20.10.2006). Nong Lam University Ho Chi Minh City.
Tiếng Anh
2. Aoki F.Y., Boivin G., Roberts N. (2007), “Influenza virus susceptibility and resistance to oseltamivir”, Antivir Ther 12(4B), PP. 603-616, Review.
3. Baigent S. J., McCauley J. W. (2001), “Glycosylation of haemagglutinin and stalk-length of neuraminidase combine to regulate the growth of avian influenza viruses in tissue culture”, Virus Res 79(1-2), PP 177-185.
4. Basler C. F. (2007), “Influenza viruses: basic biology and potential drug targets”, Infect Disord Drug Targets 7(4), PP 282-293, Review.
5. Bender C., Hall H., Huang J., Klimov A., Cox N., Hay A., Gregory V., Cameron K., Lim W. and Subbarao K. (1999), “Characterization of the surface proteins of influenza A (H5N1) viruses isolated from humans in 1997 – 1998”, Virology 254, pp 115-123.
6. Bosch F. X., Garten W., Klenk H. D., Rott R. (1981), “Proteolytic cleavage of influenza virus hemagglutinins; primary structure of the connecting peptide between HA1 and HA2 determines proteolytic cleavability and pathogenicity of avian influenza viruses”, Virology 113, pp 725-735.
7. Bublot M.,Pritchard N., Swayne D. E.,Selleck P.,Karaca K.,Suarez D. L., Audonnet J. C.,Mickle T. R. (2006), “Development and use of fowlpox vectored vaccines for avian influenza”. Ann N Y Acad Sci,pp 193-201.
8. Castrucci M. R., Kawaoka Y. (1993), “Biologic importance of neuraminidase stalk length in influenza A virus”, J Virol67, pp 759-764.
48
9. Chen H., Deng G., Li Z., Tian G., Li Y., Jiao P. (2004), “The evolution of H5N1 influenza viruses in ducks in southern China”, Proc Natl Acad Sci USA 101, pp 10452-10457.
10. Chen L. M., Davis C. T., Zhou H., Cox N. J., Donis R. O. (2008), “Genetic compatibility and virulence of reassortants derived from contemporary avian H5N1 and human H3N2 influenza A viruses”. PLoS Pathog 4(5), e1000072. 11. Conenello G.M., Zamarin D., Perrone L.A., Tumpey T., Palese P. (2007), “A
single mutation in the PB1-F2 of H5N1 (HK/97) and 1918 influenza A viruses contributes to increased virulence”, PLoS Pathog 3(10), pp 1414-1421.
12. Doherty P. C., Turner S. J., Webby R. G., Thomas P. G. (2006), “Influenza and the challenge for immunology”, Nat Immunol 7(5), pp 449-55, Review.
13. Ellebedy A. H., Webby R.J. (2009), Influenza vaccines, Vaccine 27, D65-D68. 14. Fouchier R. A., Smith D. J. (2010), “Use of antigenic cartography in
vaccine seed strain selection”, Avian diseases, PP 220-223.
15.Glick B.R. and Pasternak J.J. (2003), Molecular Biotechnology, ASM Press, Washington DC.
16. Hilleman M. (2002), “Realities and enigmas of human viral influenza: pathogenesis, epidemiology and control”, Vaccine 20 (25-26), PP 3068-3087. 17. Horimoto T., Kawaoka Y. (2001) “Pandemic threat posed by avian influenza A
viruses”, Clin Microbiol Rev 14(1), PP 129-149.
18. Ito T., Couceiro J. N., Kelm S., Baum L. G., Krauss S., Castrucci M. R., Donatelli I., Kida H., Paulson J. C., Webster R. G. and Kawaoka Y. (1998), “Molecular basis for the generation in pigs of influenza A viruses with pandemic potential”, J Virol 72, PP 7367-7373.
19. Kamp B. S., Hoffmann C., Preiser W. (2006), Influenza report .
20. Kash J.C., Goodman A.G., Korth M.J., Katze M.G. (2006), “Hijacking of the host-cell response and translational control during influenza virus infection”, Virus Res 119(1), PP 111-120, Review.
49
21. Keawcharoen J., Amonsin A., Oraveerakul K., Wattanodorn S., Papravasit T., Karnda S., Lekakul K., Pattanarangsan R., Noppornpanth S., Fouchier R. A., Osterhaus A. D., Payungporn S., Theamboonlers A. and Poovorawan Y. (2005), “Characterization of the hemagglutinin and neuraminidase genes of recent influenza virus isolates from different avian species in Thailand”, Acta Virol 49(4), PP 277-280.
22. Li S., Liu C., Klimov A., Perdue M. L., Mo D., Ji Y, Woods L., Hietala S., Bryant M. (1999), "Recombinant influenza A virus vaccines for the pathogenic human A/Hong Kong/97 (H5N1) viruses", Infect Dis179, PP 55-60.
23. Macken C.A., Webby R.J., Bruno W.J. (2006), “Genotype turnover by reassortment of replication complex genes from avian influenza A virus”, J Gen Virol 87(10), PP 2803-2815.
24. Matrosovich M., Zhou N., Kawaoka Y., Webster R. (1999), “The surface glycoproteins of H5 influenza viruses isolated from humans, chickens, and wild aquatic birds have distinguishable properties”, J Virol 73, PP 1146-1155. 25. Murphy B. R., Webster R. G. (1996), Orthomyxoviruses, In Fields BN, Knipe DM, Howley PM, (eds.), Fields Virology, 3rd ed, Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, PP 1397-1445.
26. Nayak D., Hui E., Barman S. (2004), “Assembly and budding of influenza virus”, Virus Res 106(2), PP 147-165.
27. Neumann G., Hatta M., Kawaoka Y. (2003), “Reverse genetics for the control of avian influenza”, Avian disease 47, PP 882-887.
28. Nicholson K. G., Wood J. M., Zambon M. (2003), “Influenza”. Lancet 362 (93970), PP 1733-1745.
29. OIE - World organisation for animal health (2005), “Avian influenza. Manual of diagnostic test and vaccines for terrestrial animals.
30. Robertson B. H., Bhown A.S., Compans R.W., and Bennett J. C. (1979), “Structure of the membrane protein of influenza virus. Isolation and characterization of cyanogens bromide cleavage products”, J Viro, 30(3), PP 759-766.
50
31. Suarez D. L., Schultz-Cherry S. (2000), “Immunology of avian influenza virus”, Dev Comp Immunol 24, PP 269-283.
32. Subbarao K., Luke C. (2007), “H5N1 viruses and vaccines”. PLoS Pathog 3(3): e40, Review.
33. Suzuki Y. (2005), “Sialobiology of influenza: molecular mechanism of host range variation of influenza viruses”. Biol Pharm Bull 28(3), PP 399-408, Review. 34. Treanor J.J., Campbell J.D., Zangwill K.M., Rowe Thomas and Wolff Mark
(2006), “Safety and Immunogenicity of anInactivated Subvirion Influenza A (H5N1) Vaccine” ,NEJM, PP 1343-1351.
35. Uiprasertkul M., Kitphati R., Puthavathana P., Kriwong R., Kongchanagul A., Ungchusak K., Angkasekwinai S., Chokephaibulkit K., Srisook K., Vanprapar N, Auewarakul P. (2007), “Apoptosis and pathogenesis of avian influenza A (H5N1) virus in humans”, Emerg Infect Dis 13(5), PP 708-712.
36. Wagner R., Matrosovich M., Klenk H. (2002), “Functional balance between haemagglutinin and neuraminidase in influenza virus infections”, Med Virol 12(3), PP 159-166.
37. Weber T. P., Stilianakis N. I. (2007), “Ecologic immunology of avian influenza (H5N1) in migratory birds”, Emerg Infect Dis 13(8), PP 1139-1143, Review. 38. Webster R. G. (1998), “Influenza: an emerging disease”, Emerg Infect Dis
4, PP 436-441.
39. Webster R.G., Guan Y., Peiris M., Walker D., Krauss S., Zhou N. N., Govorkova E. A., Ellis T. M., Dyrting K. C., Sit T., Perez D.R., Shortridge K.F. (2002), “Characterization of H5N1 influenza viruses that continue to circulate in geese in southeastern China”, J Virol 76(1), PP 118-126.
40. Weiss R.A. (2003), Cross-species infections. Curr Top Microbiol Immunol 278, PP 47-71.
41. WHO (2005), “Avian influenza A (H5N1) infection in humans”, NEJM, 1374 42. Wu C., Cheng X., He J., Wang J., Deng R., Long Q., Wang X. (2008), “A
multiplex real-time RT-PCR for detection and identification of influenza virus types A and B and subtypes H5 and N1”, J Virol Methods 148(1-2), PP 81-88.
51
43. Yamada S., Suzuki Y., Suzuki T., Le M. Q., Nidom C. A., Sakai-Tagawa Y., Muramoto Y., Ito M., Kiso M., Horimoto T., Shinya K., Sawada T., Kiso M., Usui T., Murata T., Lin Y., Hay A., Haire L. F., Stevens D. J., Russell R. J., Gamblin S. J., Skehel J. J., Kawaoka Y. (2006), “Haemagglutinin mutations responsible for the binding of H5N1 influenza A viruses to human-type receptors”, Nature 444(7117), PP 378-382.
44. Zhou J. J., Fu J., Fang D. Y., Yan H. J., Tian J., Zhou J. M., Tao J. P., Liang Y., Jiang L. F. (2007), “Molecular characterization of the surface glycoprotein genes of an H5N1 influenza virus isolated from a human in Guangdong, China”, Arch Virol 152(8), 1515-1521.