2.2.11.1 Gây miễn dịch và thu huyết thanh gà
Chuẩn bị protein tái tổ hợp để tiêm gà
- Protein TrxHA5-1 sau khi tinh chế được thẩm tích trong đệm PBS và định lượng bằng phương pháp Bradford. Sau đó, 100 µg TrxHA5-1 được hòa vào 250 µl tá chất Freund toàn phần (Complete Freund Adjuvant) cho lần gây miễn dịch đầu tiên hoặc 250 µl tá chất Freund bán toàn phần (Incomplete Freund Adjuvant) cho gây miễn dịch lần sau. Sau đó bổ sung thêm nước sao cho tổng thể tích của mỗi liều gây miễn dịch là 500 µl. Tương tự như vậy, để chuẩn bị mẫu cho gây miễn dịch cho gà theo đường uống, chúng tôi cũng trộn 100 µg TrxHA5-1 với 15 g tá chất Ctb (Cholera Toxin B) và dẫn nước tới 500 µl.
Bố trí thí nghiệm trên gà
Gà giống Lương Phượng, đeo nhẫn cá thể, nuôi trong cùng điều kiện như nhau, đến 14 ngày tuổi. Sau đó gà được phân thành 4 lô thí nghiệm (mỗi lô 5 cá thể). Gà trong mỗi lô được gây miễn dịch với liều lượng protein tái tổ hợp nhưsau:
Lô 1: Gây miễn dịch bằng đường tiêm với đệm PBS
Lô 2: Gây miễn dịch cho gà bằng đường tiêm với dịch lên men chủng đối chứng
Lô 3: Gây miễn dịch cho gà bằng cách tiêm dưới da cổ, 2/3 cổ tính từ đầu xuống, với 100 µg TrxHA5-1 có trộn tá chất Freund
Lô 4: Gây miễn dịch cho gà bằng cách nhỏ mũi, mắt với 100 µg
29
Sau khi gây miễn dịch lần 1 được 14 ngày, gà được gây miễn dịch lần 2. Sau khi gây miễn dịch 1, 2, 3, 4, 5 tuần, huyết thanh được thu nhận lại để kiểm tra hiệu giá kháng thể.
2.2.11.2 Phản ứng ngăn trở ngƣng kết hồng cầu (HI) Cơ sở lý thuyết
Trên bề mặt của virus cúm có kháng nguyên HA. Kháng nguyên này có thụ thể trên bề mặt tế bào hồng cầu của một số loài gia súc, gia cầm. Vì vậy, khi cho virus tiếp xúc với hồng cầu, kháng nguyên HA sẽ liên kết với hồng cầu làm cho hồng cầu bị ngưng kết thành lớp màng mỏng, không bị sa lắng. Hiện tượng này có thể quan sát bằng mắt thường. Nếu gặp được kháng thể đặc hiệu tương ứng, kháng thể sẽ bắt cặp với kháng nguyên trên bề mặt virus, làm cho kháng nguyên này không liên kết được với hồng cầu. Do đó, hồng cầu sẽ bị lắng xuống và không tạo thành dạng ngưng kết. Vì vậy, phản ứng này được gọi là phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu (HI).
Chuẩn bị hồng cầu gà
Dùng bơm kim tiêm vô trùng hút sẵn 1 ml dung dịch citrate natri 5%, sau đó lấy 2 ml máu ở tĩnh mạch cánh gà trống khỏe, không tiêm vaccine cúm gia cầm và Newcastle.
Cho máu vào ống nghiệm vô trùng rồi ly tâm 1000-1500 vòng/phút trong 5 phút. Sau khi ly tâm xong hút bỏ huyết tương, cho thêm nước muối sinh lý (NaCl 0,85%) vào ống nghiệm, lắc nhẹ đều. Làm như trên 3-4 lần để rửa hồng cầu, lần ly tâm cuối cùng hút bỏ phần nước trong phía trên.
Bảo quản hồng cầu ở 4-8oC. Hồng cầu sau khi pha có thể dùng trong 4-5 ngày. Hồng cầu bị dung huyết thì loại bỏ không dùng.
Chuẩn độ hiệu giá kháng nguyên
- Cho 50µl NaCl 0,85% vào tất cả 12 giếng của đĩa TaKaShi
- Cho 50 µl kháng nguyên vào giếng 1, dùng pipet trộn đều rồi hút 50 µl sang giếng 2, trộn đều, làm tương tự đến giếng thứ 11. Như vậy kháng nguyên được pha loãng theo bậc 2. Giếng thứ 12 làm đối chứng hồng cầu.
30
- Cho vào tất cả các giếng 50 µl hồng cầu gà 0,5%, lắc nhẹ đĩa, để nhiệt độ phòng trong 30 phút, đọc kết quả:
Phản ứng dương tính: Xuất hiện ngưng kết ở đáy giếng. Phản ứng âm tính: Hồng cầu lắng xuống đáy giếng.
Tiến hành phản ứng ngăn trở ngƣng kết hồng cầu vi lƣợng (HI)
- Pha kháng nguyên chuẩn 4HA
- Cho 50µl NaCl 0,85% vào tất cả 12 giếng của đĩa TaKaShi
- Cho 50 µl huyết thanh cần kiểm tra vào giếng 1, dùng pipet trộn đều rồi hút 50 µl sang giếng 2, trộn đều, làm tương tự đến giếng thứ 11.
- Nhỏ kháng nguyên chuẩn từ giếng 1 đến giếng 11. Giếng thứ 12 làm đối chứng hồng cầu.
- Cho vào tất cả các giếng 50 µl hồng cầu gà 0,5%, lắc nhẹ đĩa, để nhiệt độ phòng trong 30 phút, đọc kết quả.
- Hiệu giá kháng thể của mẫu được tính ở độ pha loãng huyết thanh cuối cùng còn có hiện tượng ức chế ngưng kết hồng cầu.
Phân tích số liệu xác định hiệu giá HI
Số liệu được xử lý theo phương pháp thống kê sinh học bằng chương trình Microsoft Excel. Công thức tính hiệu giá kháng thể trung bình (GMT).
GMT= (T1 x T2 x T3 x…..Tn)n 1 →Log2 GMT = Log2(T1 x T2 x T3 x…..Tn)n 1 = A → GMT = 2A hoặc GMT = A log2
Trong đó: T1, T2, T3, …Tn là hiệu giá kháng thể của từng mẫu huyết thanh từ các con gia trong lô thí nghiệm; n: tổng số mẫu
31
Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Với đề tài nghiên cứu biểu hiện, tinh chế và đánh giá khả năng sinh đáp ứng miễn dịch của protein HA5-1 tái tổ hợp biểu hiện trong E. coli, chúng tôi đã tiến hành những nội dung nghiên cứu sau:
Sử dụng cặp enzyme NcoI và BamHI để cắt plasmid pCRha5-l và pET22trx do phòng Kỹ thuật di truyền thiết kế (Hình 3.1). Đoạn gen ha5-1 và vector pET22trx mở vòng được thu lại từ gel agarose 1% bằng cột QUIAGEN. Sau đó ghép nối đoạn gen ha5-l vào vector biểu hiện pET22trx tạo thành plasmid tái tổ hợp pET22trxha5-l.
Để kiểm tra các sản phẩm của quá trình ghép nối, chúng tôi tiến hành biến nạp vector tái tổ hợp pET22trxha5-l vào vi khuẩn E. coli DH5α. Sau đó tiến hành nuôi cấy, tách chiết và cắt plasmid pET22trxha5-l bằng chính hai enzyme cắt giới hạn
NcoI và BamHI. Điện di trên gel agarose 0,8% và so sánh kích thước các vạch thu được với kích thước của đoạn gen ha5-1 và vector pET22trx.
Biểu hiện sản phẩm của gen ha5-1 bằng cách biến nạp vector tái tổ hợp pET22trxha5-l vào chủng biểu hiện E.coli BL21. Sau đó tiến hành tối ưu các điều kiện biểu hiện của protein tái tổ hợp TrxHA5-l về nồng độ chất cảm ứng IPTG, thời gian và nhiệt độ.
Sử dụng dung dịch đệm urê để tinh chế protein tái tổ hợp thu được và kiểm tra tính kháng nguyên của protein này bằng phương pháp Western Blot, khả năng gây đáp ứng miễn dịch của protein tái tổ hợp bằng thí nghiệm ngăn trở ngưng kết hồng cầu.
Toàn bộ quy trình tiến hành thí nghiệm biểu hiện, tinh chế và đánh giá khả năng sinh đáp ứng miễn dịch của protein HA5-1 tái tổ hợp biểu hiện trong E. Coli
32 pCRha1 4,9 Kb LacZ F1ori Kan Amp pUC ori Plac ha1 BamHI NcoI NcoI + BamHI T4 DNA ligase pET22Trxha1 6,9 Kb trxA T7p LacI ori(3684) Amp f1 ori T7t Histag pET22Trx 5,9 Kb T7t Histag trxA T7p LacI ori(3684) Amp f1 ori
XhoI...Not I...HindIII... BamHI...NcoI...Xba I...
NcoI + BamHI
ha1
Biến nạp pET22trxha5-1 vào tế bào E. coli DH5α
Chọn dòng tế bào mang plasmid tái tổ hợp chứa gen ha5-1
Biểu hiện gen ha5-1 trong tế bào E. coli BL21
Tinh sạch protein tái tổ hợp Trxha5-1 Kiểm tra tính kháng nguyên của Trxha5-1 Lựa chọn điều kiện biểu hiện protein tái tổ hợp
Kiểm tra khả năng sinh đáp ứng miễn dịch của protein tái tổ hợp
33