Để kiểm tra khả năng gây đáp ứng miễn dịch của protein tái tổ hợp khi sử dụng trong mục đích chế tạo vaccine, cần phải thu được protein này ở dạng tinh sạch. Vì vậy, chúng tôi tiến hành nuôi cấy cảm ứng thu lượng lớn protein để chuẩn bị cho bước tinh chế.
Để thu được protein dạng tinh sạch, người ta thường dựa vào các đặc điểm tương đồng và các tính chất khác nhau vốn có của nó. Căn cứ vào nhiều đặc tính
Hình 3.8: Protein tổng số từ chủng tái tổ hợp E.coli BL21 mang vector pET22Trxha5-1
được cảm ứng bằng 0,5 mM IPTG ở các thời gian thu mẫu khác nhau; 1-5 : Thời gian thu mẫu sau khi cảm ứng tương ứng 1, 2, 3, 4, 5 giờ; 6: Thang protein chuẩn (Fermentas) kDa 116 66 45 35 25 18.4 14.4 TrxHA5-1 1 2 3 4 5 6
41
như sự khác nhau về hình dạng, kích thước, điện tích, tính ưa nước, khả năng tan và không tan.
Trong một số trường hợp, để dễ dàng cho việc tinh chế, người ta biểu hiện protein dưới dạng dung hợp với peptide có ái lực với ion kim ví dụ như His-tag, có ái lực với kháng thể như Myc-tag,... Trong nghiên cứu này, gen ha5-1 cũng được dung hợp với đoạn gen mã hóa cho 6 amino acid Histidine ở phía đầu N và đầu C của
HA5-1. Vì vậy, có thể dựa vào đặc tính này để tinh chế protein tái tổ hợp. Tuy nhiên, phần lớn TrxHA5-1 được tổng hợp trong E. coli dưới dạng không tan nên protein này có thể được phân tách dễ dàng với protein tan của tế bào bằng cách ly tâm thu cặn sau đó cặn chứa TrxHA5-1 được pha lại trong đệm urê 2 M và DTT 10 mM.
Quy trình tinh chế protein đã được trình bày trong phần phương pháp.
Để tinh chế protein tái tổ hợp, trước hết tế bào được phá bằng siêu âm, sau đó ly tâm loại bỏ pha tan trong nước. Để loại bỏ các protein tan trong nước khác, tủa tiếp tục được rửa lại 2 lần bằng nước và rửa bằng đệm B1, sau đó tủa được hòa tan bằng dung dịch B2 chứa urê 2 M để thu nhận TrxHA5-1. Chúng tôi đã thử nghiệm hòa tan tủa protein trong đệm urê 4 M nhưng ở trong đệm này hầu hết các protein không tan khác cũng bị tan ra và nồng độ urê 2 M là nồng độ thích hợp cho việc làm tan protein tốt nhất. Ở nồng độ này, một phần nhỏ protein không tan có lẫn trong mẫu được loại bỏ.
Hình 3.9: Điện di kiểm tra Trxha5-1 tinh chế trên gel polyacrylamide; 1- Protein tổng
số E. coli BL21 mang plasmid pETT22Trxha5-1;2-Thang protein chuẩn; 3: phân đoạn
chứa Trx-HA5-1 hòa tan trong urê 2 M.
kDa 116 66 45 35 25 18.4 14.4 1 2 3 TrxHA5-1
42
Kết quả (Hình 3.9, đường chạy 3) cho thấy protein tái tổ hợp thu được sau khi loại bỏ pha tan là khá sạch, được thể hiện một băng protein có kích thước khoảng 57,5 kDa khá đậm và sạch hơn rất nhiều so với protein ban đầu. Tuy nhiên, trong mẫu vẫn còn lẫn một số băng protein có kích thước xấp xỉ 40, 45 kDa. Các protein này có thể là protein của vi khuẩn hoặc protein do TrxHA5-1 bị phân cắt hoặc bị đứt gãy tạo ra.
Đối với protein tái tổ hợp sử dụng trong vaccine, một điểm rất quan trọng là phải có tính kháng nguyên giống với tính kháng nguyên của protein tự nhiên. Vì lý do này, protein sau khi tinh chế sẽ được tiến hành thử khả năng đáp ứng đặc hiệu với kháng thể kháng virus cúm A/H5N1 thu được từ thỏ bằng kỹ thuật Western blot.
Trong thí nghiệm này, protein tái tổ hợp TrxHA5-l được cố định trên màng PVDF, sau đó, ủ màng với kháng thể tự nhiên kháng HA5 thu được từ thỏ nhiễm virút cúm H5N1. Tiếp tục ủ màng với kháng thể cộng hợp là kháng thể nhận biết kháng thể tự nhiên kháng HA5. Ngoài ra, trên kháng thể cộng hợp còn gắn enzyme peroxidase (horse radish peroxidase- HRS). Do đó, thông qua phản ứng màu của enzyme, có thể phát hiện được phức hợp kháng nguyên và kháng thể nói trên.
Kết quả kiểm tra tính kháng nguyên của protein thể hiện trên hình 3.10
A B
Hình 3.10: Kiểm tra tính kháng nguyên của protein TrxHA5-1 tái tổ hợp; (A) Phân tích
protein trên gel điện di polyacrylamide; (B): Phân tích khả năng bắt cặp đặc hiệu của kháng nguyên tái tổ hợp với kháng thể kháng lại HA5 của virus cúm A/H5N1; 1- phân đoạn chứa TrxHA5-1 sau khi tinh chế; 2 - Thang protein chuẩn; 3 - Protein tổng số E. coli
BL21 mang plasmid pETT22Trx.
1 2 3 TrxHA5-1 kDa 116 66 35 25 18.4 14.4 kDa 116 66 45 35 25 18.4 14.4 1 2 3 TrxHA5-1
43
Quan sát trên màng PVDF, trên hình 3.10 (B) ta thấy đường chạy số 3 là protein tổng số tách chiết từ chủng vi khuẩn E. coli BL21 mang vector pET22trx không mang gen ha5-l, không thấy sự xuất hiện của băng màu có kích thước tương ứng với gen TrxHA5-l. Trong khi đó trên đường chạy số 1 xuất hiện băng protein rất rõ nét, kích thước khoảng 57,5 kDa có khả năng kết hợp đặc hiệu với kháng thể kháng virus cúm A/H5N1. Điều đó chứng tỏ kháng nguyên tái tổ hợp TrxHA5-l được tổng hợp trong E. coli với trình tự amino acid chính xác chứa các quyết định kháng nguyên nằm trên tiểu phần ha5-1.
Đúng như dự đoán ở phần trên, các protein có kích thước khoảng 45 và 40 kDa có lẫn trong sản phẩm TrxHA5-1 tinh sạch chính là sản phẩm TrxHA5-1 bị đứt gãy hoặc bị phân cắt. Vì các phần bị phân cắt vẫn còn các vùng epitope liên kết đặc hiệu với kháng thể nên khi lai Western blot, các đoạn peptide này đã liên kết khá tốt với kháng thể kháng HA.