Trong số các chỉ thị ADN, RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism-có nghĩa là ựa hình ựộ các ựoạn cắt giới hạn), là chỉ thị thế hệ ựầu tiên, ựược phát triển sớm nhất và ban ựầu ựược sử dụng trong nghiên cứu di truyền ở người (Botstein, 1980) [26]. Trong hệ gen vi sinh vật thường xảy ra các quá trình làm thay ựổi trình tự ADN như các ựột biến ựiểm, ựột biến thêm-bớt ựoạn DNA (với số lượng từ vài chục ựến vài trăm cặp nucleotide) hay sự sắp xếp lại các ựoạn nhiễm sắc thể trong quá trình phân ly-tái tổ hợp. Những biến ựổi này có làm tăng, giảm hoặc dịch chuyển các vị trắ giới hạn (vị trắ nhận biết các en zyme giới hạn). Khi sử dụng các enzyme giới hạn ựể cắt ADN hệ gen, những thay ựổi của vị trắ nhận biết sẽ tạo ra các mảnh ADN có kắch thước khác nhau (Henry và cs., 2006) [45].
Về nguyên lý, chỉ thị RFLP dựa trên sự phân cắt ADN hệ gen bằng các enzyme giới hạn và sản phẩm cắt giới hạn có thể ựược phát hiện bởi quá trình lai Southern với các mẫu dò ựánh dấu phóng xạ (ựoạn trình tự ADN ựẵ hiệu ựược thiết kế ựể có thể bắt cặp bổ sung và qua ựó phát hiện ựược trình từ ADN mục tiêu) sau khi ựiện di trên gel agarose (Somasundaram và Kalaiselvam, 2007) [96]. RFLP là chỉ thị ựồng trội do có thể phát hiện ựược cacs alen khác nhau của một locus trong hệ gen nhân, hệ gen ti thể hay hệ gen lục lạp bằng
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 25
một mẫu dò ựặc hiệu. Qua kết quả của phản ứng lai chúng ta có thể xác ựịnh ựược sự ựa hình giữa các mẫu ADN khác nhau (Peer và Wachter, 1994) [83].
Lai axit nucleic gồm 2 kiểu, lai ADN (DNA hybridization) hay còn gọi là lai Southern và lai ARN (RNA hybridization) hay còn gọi là lai Northern. Về nguyên tắc lai Northern cũng tương tự như lai Southern, chỉ khác là lai Northern ựược thực hiện giữa mẫu dò với ARN thông tin (mARN) và trong phép lai này không có bước xử lý enzyme giới hạn.
để thực hiện một quy trình lai axit nucleic cần tiến hành rất nhiều khâu thao tác phức tạp, trên nhiều loại vật liệu khác nhau: tách chiết thu ADN khuôn, xử lý mẫu bằng enzyme giới hạn, ựiện di và chuyển ADN lên màng lai, chuẩn bị mẫu dò, cuối cùng thực hiện lai và phát hiện tắn hiệu. Do vậy, kỹ thuật này có giá thành cao, mất nhiều thời gian và công sức. điều này làm cho việc ứng dụng nó ắt nhiều bị giới hạn.
Tuy có hạn chế nhưng RFLP vẫn ựược ứng dụng rộng rãi nhờ khả năng phát hiện hiệu quả gen ựắch dựa trên mẫu dò. đồng thời RFLP là chỉ thị ựồng trội, giúp phân biệt ựược cá thể ựồng hợp tử và dị hợp tử của quần thể F2. Chắnh vì thế kỹ thuật này ựược sử dụng trong lập bản ựồ gen, phân lập gen, xác ựịnh số bản sao của một gen, phân tắch cấu trúc và chức năng gen, xác ựịnh nồng ựộ và kắch thước mARN,.v.v, ựặc biệt nhất là nó thường ựược sử dụng trong các trường hợp cần kiểm chứng ựộ tin cậy của các chỉ thị khác (Lã Tuấn Nghĩa, 2005) [10].
RFLP là chỉ thị ựược dùng phổ biến trong lập bản ựồ di truyền. Ở lúa việc sử dụng chỉ thị phân tử ựể lập bản ựồ di truyền ựã ựược tiến hành từ rất sớm. Năm 1988, Couch và cs., ựã thiết lập bản ựồ liên kết gen ựầu tiên trên
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 26
cây lúa bằng chỉ thị phân tử RFLP, với 135 locus. Bản ựồ ựã phủ trên 12 nhiễm sắc thể với chiều dài tổng cộng là 1,389 cM trên hệ gen cây lúa từ cặp lai IR34583 (Indica) và Bulu Dalam (Javanica).
đối với bệnh ựạo ôn, từ những năm 1985 bản ựồ gen kháng ựạo ôn ựầu tiên ựã ựược thiết lập bởi Inbe và Matsumoto dựa trên các chỉ thị RFLP. Tiếp theo là hàng loạt các bản ựồ gen kháng ựạo ôn mới ựã ựược xây dựng: Wang và cs., (2001); Sallaud và cs., (2003),.v.v. [104]; [91].