PHƯƠNG PHÁP CHIẾU XẠ GAMMA COBAN- 60
Trên cơ sở những nội dung nghiên cứu và kết quả thực nghiệm thu được, tiến hành đề xuất quy trình sản xuất oligochitosan bằng phương pháp chiếu xạ gamma Co-60 với các thông số tối ưu đã lựa chọn:
Hình 3.20. Sơ đồ quy trình sản xuất oligochitosan bằng phương pháp chiếu xạ gamma Coban-60
Thuyết minh quy trình
- Hòa tan trong acid: chitosan thu được khi áp dụng phương pháp sản xuất đã trình bày có độ deacetyl 85%, được hòa tan trong acid acetic 1% (v/v) với hàm lượng chitosan 10% (w/v), khuấy và để ổn định trong 5 giờ.
- Cho vào lọ: sau khi hòa tan trong acid acetic 1%, dung dịch chitosan được cho vào lọ thủy tinh có đậy nút mài kín để tiến hành chiếu xạ.
- Chiếu xạ: sau khi chuẩn bị xong mẫu, tiến hành chiếu xạ trên nguồn gamma Coban-60, liều chiếu: 25- 50 kGy.
- Oligochitosan: sản phẩm oligochitosan sau khi chiếu xạ được xác định về trọng lượng phân tử trung bình, tách phân đoạn, xác định biến đổi cấu trúc chitosan sau khi chiếu xạ và đánh giá hiệu ứng sinh học.
Chitosan
Hòa tan trong acid
Chiếu xạ Độ deacetyl: 85% Độ ẩm: 9,5% Oligochitosan Xác định TLPT trung bình
Tách phân đoạn Đánh giá hiệu
ứng sinh học Đo FTIR Cho vào lọ Acid acetic 1% (v/v) Chitosan 10% (w/v) Liều chiếu: 25-50 kGy
Xác định trọng lượng phân tử: mẫu chitosan sau khi chiếu xạ được xác định TLPT để đánh giá khả năng cắt mạch của bức xạ, TLPT là yếu tố quan trọng để đánh giá các tính chất hóa học và hiệu ứng sinh học của oligochitosan.
Khối lượng phân tử của chitosan sau chiếu xạ được xác định bằng phương pháp đo độ nhớt, sử dụng nhớt kế Ubbelohde Ф = 0,73 mm. Các mẫu chitosan được tạo thành dung dịch với hệ dung môi là 0,1M CH3COOH/ 0,2M NaCl, đo ở các nồng độ khác nhau, đo đạc lặp lại ba lần và kết quả là giá trị trung bình.
Tách phân đoạn: thu được các phân đoạn có dải trọng lượng phân tử hẹp đáp ứng mong muốn và mục đích ứng dụng trong thực tiễn. Đồng thời xác định được hàm lượng oligochitosan các phân đoạn có trong dải trọng lượng phân tử đó. Methanol và aceton là hai dung môi đặc hiệu sử dụng trong quá trình phân đoạn
Phân đoạn 1
Dung dịch chitosan sau khi chiếu xạ ta tiến hành lọc để loại bỏ các tạp chất không tan rồi trung hòa dịch lọc bằng muối NaHCO3 50% (muối có nồng độ cao để tránh làm tăng thể tích của dung dịch) cho đến khi pH bằng 6.
Thêm từ từ methanol vào dung dịch chitosan theo tỷ lệ 2:1 (methanol:chitosan), dung dịch dần tạo tủa, dùng đũa thủy tinh khuấy nhẹ rồi tiến hành ly tâm trong máy ly tâm với tốc độ 4500 rpm trong thời gian 25 phút. Ta thu được tủa và dịch lọc, rửa lại tủa bằng dung dịch methanol/ nước với tỷ lệ 2:1, tủa thu được đem đi sấy chân không ở 60oC đến khối lượng không đổi (Phân đoạn 1). Dịch lọc thu được ta tiếp tục đem đi cô trong thiết bị cô quay chân không đến thể tích bẳng 1/10 để phân đoạn tiếp theo.
Phân đoạn 2
Dịch thu được sau phân đoạn 1 ta tiếp tục tủa bằng methanol
Thêm từ từ Methanol vào dung dịch chitosan theo tỷ lệ 9:1 (methanol:chitosan), dung dịch dần tạo tủa, dùng đũa thủy tinh khuấy nhẹ rồi tiến hành ly tâm trong máy ly tâm với tốc độ 4500 rpm trong thời gian 25 phút. Ta thu được tủa và dịch lọc, rửa lại tủa bằng dung dịch methanol/ nước với tỷ lệ 9:1, tủa thu được đem sấy chân không
ở 60oC đến khối lượng không đổi (Phân đoạn 2). Dịch lọc thu được ta tiếp tục đem đi cô trong thiết bị cô quay chân không đến thể tích bẳng 1/10 để phân đoạn tiếp theo.
Phân đoạn 3
Dịch lọc thu được sau khi cô bằng thiết bị cô quay chân không ở phân đoạn 2 ta tiến hành tiếp tục cho tủa bằng aceton
Cho từ từ aceton vào dung dịch chitosan theo tỷ lệ 9:1 (aceton:chitosan), dùng đũa thủy tinh khuấy nhẹ rồi để yên để các phân tử kết tinh lắng xuống đáy cốc, rồi tiến hành lọc bằng giấy lọc để thu tủa.Ta thu được tủa là các tinh thể, rửa lại tủa bằng dung dịch aceton / nước với tỷ lệ 9:1, tủa thu được đem đi sấy chân không đến khối lượng không đổi (Phân đoạn 3).
Đo FTIR: xác định biến đổi cấu trúc của chitosan và chitosan phân đoạn sau chiếu xạ 50 kGy.
Mẫu chitosan chưa chiếu xa.
Mẫu chitosan phân đoạn 1 sau khi chiếu xạ 50 kGy.
Mẫu chitosan phân đoạn 3 sau khi chiếu xạ 50 kGy.
Đánh giá hiệu ứng sinh học: tiến hành đánh giá hiệu ứng sinh học của chitosan chiếu xạ đối với vi khuẩn Bacillus subtilic. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Mẫu chitosan và phân đoạn được hòa tan thành dung dịch 1% trong acid , điều chỉnh về pH 7 bằng dung dịch NaOH, từ dung dịch gốc này ta tiến hành pha loãng đến các nồng độ 200, 400 và 600 ppm rồi tiến hành hấp vô trùng.
Dùng que cấy đầu tròn vô trùng lấy một lượng vi sinh vật nhất định từ ống giống cho vào ống nghiệm chứa môi trường vô trùng, lắc đều ống nghiệm. Lần lượt cho 1mL huyền dịch vi khuẩn vào các ống nghiệm có chứa dung dịch ở các nồng độ: 200, 400 và 600 ppm cùng với ống đối chứng và ủ trong 24 giờ.
Định lượng lượng vi khuẩn còn sống trong các dung dịch ở các nồng độ khác nhau và ống đối chứng sau 24 giờ. Định lượng bằng phương pháp đếm khuẩn lạc: Pha loãng bậc 10 mẫu cần kiểm tra bằng nước muối sinh lý đến nồng độ thích hợp.
Cấy 0,1 mL mỗi nồng độ pha loãng trên bề mặt đĩa thạch môi trường thạch thường, dùng que gạt vô trùng dàn dịch cấy ra khắp bề mặt môi trường. Mỗi độ pha loãng cấy 2 đĩa. Lật ngược đĩa, đem ủ ở 30 – 37oC trong 24 giờ. Đếm khuẩn lạc. Chọn độ pha loãng có số khuẩn lạc từ 30 đến 300 khuẩn lạc trên một đĩa để đếm và tính kết quả.
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN