pháp chiếu xạ gamma Coban - 60
2.3.1.1. Xác định độ hòa tan của chitosan trong các dung môi acid
Xác định acid và nồng độ acid thích hợp nhất để hòa tan chitosan
Từ tham khảo tài liệu của thầy Trang Sỹ Trung, cô Trần Thị Luyến và các bài báo cáo cho thấy chitosan có độ deacetyl ≥ 80 % có thể hòa tan tốt trong dung dịch acid acetic 1 - 2% và acid citric 3 - 5%. Vì các chitosan có độ deacetyl khác nhau thì khả năng hòa tan trong acid cũng khác nhau. Do đó, đối với mẫu chitosan được tiến hành bố trí thí nghiệm xác định độ hòa tan trong dung dịch acid acetic 1 - 5 % và acid citric 1 - 5 % theo các bước như sau.
Bố trí thí nghiệm đối với acid acetic
Mục đích: bố trí thí nghiệm với nhiều nồng độ acid acetic khác nhau để xác định nồng độ acid acetic thích hợp nhất có thể hòa tan tốt chitosan đang sử dụng.
Sơ đồ bố trí thí nghiệm:
Hình 2.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định độ tan của chitosan trong acid acetic
Cách tiến hành:
Chuẩn bị 5 cốc 250 mL, đánh số các cốc lần lượt là 1, 2, 3, 4 và 5.
Cân 1g mẫu chitosan cho vào cốc, cho thêm vào mỗi cốc 100 mL nước cất và ngâm khoảng 40 phút. Sau đó vớt ra, để ráo. Cho vào mỗi cốc 100 mL dung dịch acid acetic với nồng độ từ 1, 2, 3, 4 và 5% vào các cốc đã được đánh dấu, khuấy đều. Để ổn định 5 giờ và tiến hành lọc các mẫu bằng giấy lọc rồi đem sấy khô ở 600C đến khối lượng không đổi. Cân và xác định độ tan theo phương pháp được trình bày trong mục 2, phụ lục 1.
Chitosan 1% (w/v) Hòa tan trong acid acetic
Khuấy, để ổn định trong 5 giờ
Lọc bằng giấy lọc
Sấy đến khối lượng không dổi
Cân và xác định độ hòa tan
Sơ đồ bố trí thí nghiệm đối với acid citric
Mục đích: bố trí thí nghiệm xác định độ hòa tan của chitosan trong acid citric ở dải nồng độ từ 1 - 5% để xác định nồng độ thích hợp nhất có thể hòa tan tốt chitosan.
Sơ đồ bố trí thí nghiệm:
Hình 2.4. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định độ tan của chitosan trong acid citric
Cách tiến hành:
Chuẩn bị 5 cốc 250 mL, đánh số lần lượt là 1, 2, 3, 4 và 5. Cân 1g mẫu chitosan cho vào cốc, cho thêm 100 mL nước cất vào và ngâm 40 phút. Sau đó, vớt ra để ráo. Cho vào cốc 100 mL dung dịch acid citric với nồng độ từ 1, 2, 3, 4 và 5% vào các cốc đã được đánh dấu, khuấy đều. Để ổn định 5 giờ và tiến hành lọc bằng giấy lọc rồi đem sấy khô ở 600C đến khối lượng không đổi. Cân và xác định độ hòa tan theo phương pháp được trình bày ở mục 2, phụ lục 1.
Chitosan 1% (w/v) Hòa tan trong acid citric
Khuấy, để ổn định trong 5 giờ Lọc bằng giấy lọc
Sấy đến khối lượng không đổi Cân và xác định độ hòa tan
Xác định mức độ hòa tan của chitosan trong dung môi acid
Mục đích: bố trí thí nghiệm với hàm lượng chitosan 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 và 10% (w/v) để xác định mức độ hòa tan tốt nhất của chitosan trong nồng độ và acid đã được chọn tránh hao phí hóa chất đồng thời cũng tiết kiệm được chi phí hóa chất khi tiến hành với mẫu lớn.
Sơ đồ bố trí thí nghiệm
Hình 2.5. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định mức độ hòa tan của chitosan trong acid
Cách tiến hành:
Chuẩn bị 10 cốc 250 mL, đánh số cho mỗi cốc từ 1 - 10. Cân 1g mẫu chitosan cho vào cốc, cho thêm 100 mL nước cất vào, sau đó ngâm để làm trương chitosan trong khoảng 40 phút. Tiến hành lọc rồi để ráo. Pha acid với nồng độ đã được chọn sau đó cho vào cốc theo tỷ lệ chitosan/ dung dịch (g/mL) là 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 và 10%, khuấy trong 10 phút, để ổn định 5 giờ, lọc và sấy khô đến khối lượng không đổi. Cân và xác định độ hòa tan theo phương pháp được trình bày ở phụ lục 1. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Lọc bằng giấy lọc
Khuấy, để ổn định trong 5 giờ Chitosan
Hòa tan trong nồng độ acid được chọn với hàm lượng chitosan (w/v)
Sấy đến khối lượng không đổi
Cân và xác định độ hòa tan
2.3.1.2. Bố trí thí nghiệm xác định liều xạ thích hợp cho việc cắt mạch chitosan tạo oligochitosan tạo oligochitosan
Chitosan là một polymer sinh học, Dưới tác dụng của bức xạ chúng sẽ xảy ra các phản ứng cắt mạch làm giảm cấp chiều dài mạch phân tử polymer, với các liều xạ khác nhau thì khả năng cắt mạch cũng khác nhau. Do đó mẫu thí nghiệm được tiến hành chiếu ở các liều xạ khác nhau để xác định khả năng cắt mạch của chitosan dưới tác dụng của bức xạ gamma coban 60. Đồng thời mẫu thí nghiệm cũng tiến hành chiếu xạ ở hai dạng: vẩy và dung dịch. Suất liều của nguồn áp dụng chiếu xạ mẫu là 3,6 kGy/h.
Bố trí thí nghiệm xác định liều xạ để cắt mạch chitosan khi chiếu xạ dạng vẩy.
Hình 2.6. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định khả năng cắt mạch chitosan tại các liều xạ khi chiếu xạ dạng vẩy.
Mục đích: xác định khả năng cắt mạch chitosan tại các liều xạ khác nhau. Chitosan
Đóng túi PE Chiếu xạ
10 (kGy) 30 (kGy) 70 (kGy) 166 (kGy)
oligochitosan
Xác định TLPT trung bình
Tách phân đoạn Đánh giá hiệu ứng sinh học
Cách tiến hành:
Chitosan thu được từ quy trình sản xuất đã được trình bày tiến hành đóng vào túi PE với khối lượng 30g/ túi sau đó đem đi chiếu xạ trên nguồn Co-60 với các liều xạ 10, 30, 70 và 166 kGy. Tiến hành xác định trọng lượng phân tử để đánh giá khả năng cắt mạch của chitosan dưới tác dụng của bức xạ khi chiếu xạ dạng vẩy.
Bố trí thí nghiệm xác định liều xạ thích hợp để chiếu xạ dung dịch chitosan.
Sơ đồ bố trí thí nghiệm:
Hình 2.7. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định khả năng cắt mạch chitosan tại các liều xạ khi chiếu xạ dạng dung dịch.
Mục đích: xác định khả năng cắt mạch của chitosan ở các liều xạ khác nhau khi chiếu xạ dạng dung dịch.
Nồng độ acid (%v/v) Hàm lượng chitosan (%w/v)
Hòa tan trong dung môi acid Cho vào lọ Chiếu xạ ((kGy) 10 15 25 50 oligochitosan Chitosan 20 Xác định TLPT trung bình Tách phân đoạn theo TLPT Đánh giá hiệu ứng sinh học
Cách tiến hành:
Cân 50g mẫu chitosan cho vào cốc, sau đó cho thêm 500 mL nước cất và ngâm trong 40 phút, vớt ra để ráo. Hòa tan chitosan trong dung dịch acid ở nồng độ và hàm lượng chitosan đã được chọn. Khuấy và để ổn định trong 5 giờ sau đó được đựng trong lọ thủy tinh có nút mài và tiến hành chiếu xạ ở các liều xạ được bố trí là: 10, 15, 20, 25 và 50 kGy.
2.3.1.3. Hiệu ứng sinh hoc của chitosan và các oligochitosan lên vi khuẩn Bacillus subtilis Bacillus subtilis
Mục đích: Nghiên cứu hiệu ứng sinh học của chitosan và oligochitosan trên vi khuẩn Bacillus subtilis nhằm định hướng ứng dụng.
Cách tiến hành:
Mẫu cần đánh giá hiệu ứng sinh học được hòa tan thành dung dịch 1% trong acid, điều chỉnh về pH = 7 bằng dung dịch NaOH, từ dung dịch gốc này ta tiến hành pha loãng đến các nồng độ 200, 400, 600 ppm rồi tiến hành hấp vô trùng.
Dùng que cấy đầu tròn vô trùng lấy một lượng vi sinh vật nhất định từ ống giống cho vào ống nghiệm chứa môi trường vô trùng, lắc đều ống nghiệm. Lần lượt cho 1mL huyền dịch vi khuẩn vào các ống nghiệm có chứa mẫu ở các nồng độ và mẫu đối chứng, Ủ 24 giờ. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Môi trường được chuẩn bị gồm glucose, NaCl, pepton, cao thịt với tỷ lệ nhất định, đun sôi cách thủy, hấp vô trùng sau đó đỗ thạch trên đĩa petri đã vô trùng.
Định lượng lượng vi khuẩn còn sống trong các dung dịch ở các nồng độ khác nhau và ống đối chứng sau 24 giờ bằng phương pháp đếm khuẩn lạc: Pha loãng bậc 10 mẫu cần kiểm tra bằng nước muối sinh lý đến nồng độ thích hợp. Cấy 0,1 mL mỗi nồng độ pha loãng trên bề mặt đĩa thạch môi trường thạch thường, dùng que gạt vô trùng dàn dịch cấy ra khắp bề mặt môi trường. Mỗi độ pha loãng cấy 2 đĩa. Lật ngược đĩa, đem ủ ở 30 – 37oC trong 24 h. Đếm khuẩn lạc. Chọn độ pha loãng có số khuẩn lạc từ 30 đến 300 khuẩn lạc trên một đĩa để đếm và tính kết quả.
Hình 2.8. Sơ đồ bố trí thí nghiệm đánh giá hiệu ứng sinh học của chitosan và oligochitosan đối với sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn Bacillus subtilis
2.4. PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU
Các thí nghiệm đều tiến hành 3 lần, kết quả là trung bình chung của các thí nghiệm và tính toán được sử dụng phần mềm Microsoft Excel 2007 để vẽ đồ thị.
Hấp vô trùng
Định lượng vi khuẩn (CFU/g)
600 ppm 200 ppm 400 ppm 0 ppm Để nguội Ủ 24 giờ acid acetic 1% Vi sinh vật (1 mL) Môi trường
Đun sôi cách thủy
Hấp vô trùng Đổ đĩa Đĩa petri Hấp vô trùng Ủ 24 giờ
2.5. THIẾT BỊ, DỤNG CỤ VÀ HÓA CHẤT
Thiết bị
- Thiết bị chiếu xạ gamma 60Co (GC – 5000) do Ấn Độ sản xuất và được lắp đặt tại Viện Nghiên cứu Hạt nhân Đà Lạt tháng 8 năm 2007. Hoạt độ phóng xạ hiện tại 4.000 Ci, suất liều ~ 3,6 kGy/giờ, vận hành theo cơ chế bán tự động. Thể tích buồng chiếu 4,4 lít. Nhiệt độ chiếu xạ 25 oC được điều hòa bằng nước.
- Máy đo quang phổ UV Spectrophotometric - 1650 PC (SHIMADZU, Nhật Bản ), dải sóng đo 190 – 900nm, cuvet sử dụng đo đạc bằng thạch anh có chiều dày 10mm.
- Máy quang phổ hồng ngoại chuỗi Fourier: JASCO, Nhật Bản, đo mẫu theo phương pháp phản xạ. Dãi sóng đo từ 400 – 4000 cm-1.
- Cân phân tích ER-182A Ấn Độ, có độ nhạy 10-4 gam .
- Cân phân tích Shinko của Nhật, độ nhạy 0,001g (DJ-300S, d= 0,001g). - Máy khuấy từ Nhật Bản, bể ổn nhiệt.
- Tủ sấy Balan, tủ sấy chân không LabTech, Hàn Quốc - Tủ cấy vi sinh, tủ ấm, tủ sấy.
- Nồi hấp vô trùng (autoclave)
- Thiết bị cô quay chân không IKA, CHLB Đức - Thiết bị ly tâm CHLB Đức.
Dụng cụ
- Nhớt kế Ubbelohde Ф = 0,73mm. - Nhớt kế Ubbelohde Ф = 0,56mm.
- Dụng cụ thủy tinh: cốc thủy tinh, pipet chia vạch, bình định mức, ống đong, phễu lọc, đũa thủy tinh, đĩa petri, que cấy, ống nghiệm.
- Micropipet (100-1000μl).
Hóa chất
- Hóa chất sử dụng gồm Acid acetic, acid citric, methanol, aceton, NaHCO3, glucose, NaCl, pepton, cao thịt được cung cấp bởi công ty hóa chất nông nghiệp Minh Phong, phường 8, thành phố Đà Lạt.
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. SẢN XUẤT CHITOSAN TỪ CHITIN
Tiến hành sản xuất chitosan từ chitin thương mại theo quy trình đã trình bày ở mục 2.1 và bảng kết quả 2.1 và 2.2 ở phụ lục 2. Chitosan được sản xuất có các đặc tính sau: độ deacety 85%, độ ẩm: 9,5% và hiệu suất sản xuất: 50 %.
3.2. XÁC ĐỊNH CÁC THÔNG SỐ CHO QUY TRÌNH SẢN XUẤT OLIGOCHITOSAN BẰNG PHƯƠNG PHÁP CHIẾU XẠ (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});