Trên cơ sở các tài liệu tham khảo của thầy Lê Hải và thầy Nguyễn Quốc Hiến. Tiến hành xây dựng quy trình dự kiến để sản xuất oligochitosan bằng phương pháp bức xạ gamma Coban - 60 như sau:
Hình 2.2. Sơ đồ quy trình dự kiến sản xuất oligochitosan bằng phương pháp chiếu xạ gamma Coban - 60
Chitosan Đóng túi/ lọ Chiếu xạ Dạng vẩy Dạng dung dịch Liều chiếu Dung môi Nồng độ dung môi Nồng độ chitosan TLPT trung bình Độ deacetyl Độ ẩm Oligochitosan Xác định TLPT trung bình
Tách phân đoạn Đánh giá hiệu
ứng sinh học Đo FTIR
Thuyết minh quy trình:
Chiếu xạ
- Dạng dung dịch: Chitosan thu được khi sản xuất theo quy trình đã được trình bày. Được hòa tan trong dung môi aicd với nồng độ acid và tỷ lệ % chitosan (% w/v) thích hợp. Dung dịch được đựng trong lọ thủy tinh có nút mài kín, được chiếu xạ trên nguồn gamma Co-60.
- Dạng vẩy: Chitosan thu được khi sản xuất theo quy trình đã được trình bày. Tiến hành lấy mẫu và đóng vào túi PE với khối lượng 30g/ túi được chiếu xạ trên nguồn gamma Co-60.
Sản phẩm Oligochitosan:
Oligochitosan tạo ra sau khi chiếu xạ được xác định trọng lượng phân tử trung bình, tách phân đoạn, xác định sự biến đổi cấu trúc và đánh giá hiệu ứng sinh học.
- Xác định trọng lượng phân tử trung bình: mẫu chitosan trước và sau khi chiếu xạ được xác định TLPT để đánh giá khả năng cắt mạch của bức xạ, TLPT là yếu tố quan trọng để đánh giá các tính chất hóa học và hiệu ứng sinh học của oligochitosan.
Khối lượng phân tử của chitosan trước và sau chiếu xạ được xác định bằng phương pháp đo độ nhớt, sử dụng nhớt kế Ubbelohde Ф = 0,73 mm. Các mẫu chitosan được tạo thành dung dịch với hệ dung môi là 0,1M CH3COOH/ 0,2M NaCl, đo ở các nồng độ khác nhau, đo đạc lặp lại ba lần và kết quả là giá trị trung bình.
- Tách phân đoạn: thu được các phân đoạn có dải trọng lượng phân tử hẹp đáp ứng mong muốn và mục đích ứng dụng trong thực tiễn. Đồng thời xác định được hàm lượng oligochitosan các phân đoạn có trong dải trọng lượng phân tử đó. Methanol và aceton là hai dung môi đặc hiệu sử dụng trong quá trình phân đoạn.
Phân đoạn 1
Dung dịch chitosan sau khi chiếu xạ ta tiến hành lọc để loại bỏ các tạp chất không tan rồi trung hòa dịch lọc bằng muối NaHCO3 50% cho đến khi pH bằng 6.
Thêm từ từ methanol vào dung dịch chitosan cho đến khi dung dịch dần tạo tủa, dùng đũa thủy tinh khuấy nhẹ rồi tiến hành ly tâm trong máy ly tâm với tốc độ 4500
rpm trong thời gian 25 phút. Ta thu được tủa và dịch lọc, rửa lại tủa bằng dung dịch methanol/ nước, tủa thu được đem đi sấy chân không ở 60oC đến khối lượng không đổi (Phân đoạn 1). Dịch lọc thu được ta tiếp tục đem đi cô trong thiết bị cô quay chân không đến thể tích bẳng 1/10 để phân đoạn tiếp theo.
Phân đoạn 2
Dịch thu được sau phân đoạn 1 ta tiếp tục tủa bằng methanol.
Thêm từ từ Methanol vào dung dịch chitosan, dung dịch dần tạo tủa, dùng đũa thủy tinh khuấy nhẹ rồi tiến hành ly tâm trong máy ly tâm với tốc độ 4500 rpm trong thời gian 25 phút. Ta thu được tủa và dịch lọc, rửa lại tủa bằng dung dịch methanol/ nước, tủa thu được đem sấy chân không ở 60oC đến khối lượng không đổi (Phân đoạn 2). Dịch lọc thu được ta tiếp tục đem đi cô trong thiết bị cô quay chân không đến thể tích bẳng 1/10 để phân đoạn tiếp theo.
Phân đoạn 3
Dịch lọc thu được sau khi cô bằng thiết bị cô quay chân không ở phân đoạn 2 ta tiến hành tiếp tục cho tủa bằng aceton.
Cho từ từ aceton vào dung dịch chitosan cho tới khi xuất hiện tủa có màu trắng, lơ lửng trong dung dịch, dùng đũa thủy tinh khuấy nhẹ rồi để yên để các phân tử kết tinh lắng xuống đáy cốc, rồi tiến hành lọc bằng giấy lọc để thu tủa. Ta thu được tủa là các tinh thể, rửa lại tủa bằng dung dịch aceton / nước, tủa thu được đem đi sấy chân không đến khối lượng không đổi (Phân đoạn 3).
- Đo FTIR: xác định biến đổi cấu trúc của chitosan và chitosan phân đoạn sau chiếu xạ. Chuẩn bị ba mẫu:
+ Mẫu chitosan chưa chiếu xa.
+ Mẫu chitosan phân đoạn 1 sau khi chiếu xạ + Mẫu chitosan phân đoạn 3 sau khi chiếu xạ
- Đánh giá hiệu ứng sinh học: chitosan chưa chiếu xạ và chitosan chiếu xạ được đánh giá hiệu ứng sinh học lên khả năng sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn
Mẫu cần đánh giá hiệu ứng sinh học được hòa tan thành dung dịch 1% trong acid, điều chỉnh về pH = 7 bằng dung dịch NaOH, từ dung dịch gốc này ta tiến hành pha loãng đến các nồng độ khác nhau rồi tiến hành hấp vô trùng.
Dùng que cấy đầu tròn vô trùng lấy một lượng vi sinh vật nhất định từ ống giống cho vào ống nghiệm chứa môi trường vô trùng, lắc đều ống nghiệm. Lần lượt cho 1mL huyền dịch vi khuẩn vào các ống nghiệm có chứa mẫu ở các nồng độ khác nhau và mẫu đối chứng, ủ 24 giờ.
Môi trường được chuẩn bị gồm glucose, NaCl, pepton, cao thịt với tỷ lệ nhất định, đun sôi cách thủy, hấp vô trùng sau đó đỗ thạch trên đĩa petri đã vô trùng.
Định lượng lượng vi khuẩn còn sống trong các dung dịch ở các nồng độ khác nhau và ống đối chứng sau 24 giờ bằng phương pháp đếm khuẩn lạc: Pha loãng bậc 10 mẫu cần kiểm tra bằng nước muối sinh lý đến nồng độ thích hợp. Cấy 0,1 mL mỗi nồng độ pha loãng trên bề mặt đĩa thạch môi trường thạch thường, dùng que gạt vô trùng dàn dịch cấy ra khắp bề mặt môi trường. Mỗi độ pha loãng cấy 2 đĩa. Lật ngược đĩa, đem ủ ở 30 – 37oC trong 24 h. Đếm khuẩn lạc. Chọn độ pha loãng có số khuẩn lạc từ 30 đến 300 khuẩn lạc trên một đĩa để đếm và tính kết quả.