L ỜI CẢM ƠN
2.2.3.Xác định hoạt độ bacteriocin
Mục đích: Thử tính đối kháng của vi khuẩn lactic đối với các vi khuẩn gây bệnh thường gặp trong thực phẩm.
Nguyên lý: Sau khi nuôi dịch lỏng vi khuẩn lactic trong 16-20 giờ, tiến hành ly tâm thu dịch bacteriocin thô và chuẩn độ để loại bỏ tác dụng của axit lactic do vi khuẩn lactic tiết ra có trong dịch, sau đó tiến hành thử hoạt tính với các chủng chỉ thị. Hoạt tính kháng khuẩn được xác định bằng phương pháp khuyếch tán trên thạch. Ở phương pháp này, chủng vi khuẩn thử nghiệm và chủng chỉ thị cùng được
nuôi trên một môi trường, và tính đối kháng thể hiện ở việc chất ức chế của chủng thử nghiệm khuyếch tán vào môi trường và gây ức chế chủng chỉ thị. Sử dụng đĩa thạch đã nuôi cấy chủng chỉ thị, sau đó tạo giếng trên thạch bằng cách đục lỗ, tra dịch của chủng thử nghiệm đã được ly tâm trước đó và ủ ở nhiệt độ thích hợp. Phương pháp này thích hợp đối với việc kiểm tra những khuẩn lạc riêng rẽ và áp dụng rộng rãi trong nghiên cứu về mặt di truyền.
Phương pháp: Sử dụng phương pháp khoan lỗ thạch để xác định hoạt tính bacteriocin theo Daeschel (1992).
- Các bước tiến hành:
Hút dịch bacteriocin thô và đo pH ban đầu, sau đó mới tiến hành chuẩn độ pH bằng dung dịch NaOH 2N để đưa về pH = 7. Bước này nhằm mục đích loại bỏ sự ảnh hưởng của axit lactic tiết ra có thể gây nhầm lẫn trong việc xác định hoạt tính của bacteriocin do vi khuẩn lactic tiết ra.
Sau đó tiến hành thử hoạt tính bằng phương pháp khếch tán trên thạch. Phương pháp này dựa trên khả năng đối kháng giữa vi sinh vật kiểm định và vi sinh vật chỉ thị. Đun nóng môi trường TSA với lượng agar là 10 g/l, có pha thêm chất màu methylen blue (2 ml/200 ml thạch mềm TSA) và làm nguội cho đến khoảng 35-380C thì hút 20 µl dịch vi khuẩn chỉ thị vào, lắc đều. Đổ 20 ml môi trường vào đĩa petri, ta để thạch đông hoàn toàn thì đục lỗ thạch. Hút 200 µl dịch bacteriocin thô tra vào lỗ thạch. Ủ đĩa thạch ở 370C trong 16-24 giờ, sau đó kiểm tra sự tạo thành vòng kháng khuẩn và đo kích thước vòng kháng.
- Đo hoạt độ theo đường kính vòng kháng khuẩn:
Đường kính vòng kháng = D - d
Trong đó: d là đường kính lỗ thạch
D là đường kính vòng kháng
- Đo hoạt độ theo đơn vị AU/ml:
Hoạt độ: A = (1000/ d) * D (Parente và cộng sự, 1994a)
Trong đó: d (dose) là liều lượng chất cần xác định hoạt tính cho vào lỗ thạch