L ỜI CẢM ƠN
2.1.2. Chủng vi khuẩn lactic T8
Chủng vi khuẩn lactic được sử dụng để thu bacteriocin dùng trong tất cả các thí nghiệm là chủng vi khuẩn lactic T8, được lấy từ bộ sưu tập các chủng vi sinh vật tại phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học, trường Đại học Nha Trang (Nguyễn Văn Duy, Lưu Thị Thúy, 2011). Chủng vi khuẩn này được bảo quản trong glycerol 20-30% ở nhiệt độ -80oC. Chủng vi khuẩn lactic T8 được nuôi cấy trên môi trường MRS (De Man, Rogosa, Sharpe), ở 37oC, pH 6,2 - 6,8.
Hình 2.1. Khuẩn lạc của vi khuẩn lactic T8 trên môi trường MRS 2.1.3. Chủng vi khuẩn chỉ thị
Các chủngSalmonella Sal 1, Bacillus B1.1 và Vibrio C1 được lấy từ bộ sưu tập vi sinh vật của phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học, trường Đại học Nha
Trang. Chủng Salmonella Sal 1 được nuôi cấy trên môi trường RV, ở pH 5,2 – 5,7 và nhiệt độ 370C trong 7-10 giờ. Chủng Bacillus B1.1 được nuôi cấy trên môi trường TSB, pH 7,3 ± 0,2, lắc 180 vòng/phút trong 7 – 8 giờ. Chủng Vibrio C1 được nuôi cấy tương tự như chủng Bacillus B1.1, đem lắc 150 vòng/ phút.
Các chủng vi khuẩn được bảo quản trong dung dịch glycerol 20 - 30%, ở - 800C. Các chủng chỉ thị được hoạt hóa trước khi thử đối kháng bằng cách lấy 1 ống giống từ tủ bảo quản chủng, sau đó hút 1 ml dịch vi khuẩn đem nuôi cấy ở những điều kiện thích hợp trên môi trường nuôi trong vòng 16 – 18 giờ.
2.1.4. Thiết bị chuyên dụng
- Máy ly tâm (Eppendorf Centrifuge 5417R, Mỹ) - Tủ lạnh (NANO Silver, Việt Nam)
- Kính hiển vi 3 mắt ngắm có camera và máy tính (Motic BA 300, Mỹ) - Máy định lượng protein bằng quang phổ hấp thụ phân tử (UV/VIS) (Carry 100 Bio, Úc)
- Máy lắc (GFL 3005, Đức)
- Tủ cấy (Telstar AV 100, OSI Co, Ltd, Tây Ban Nha) - Tủ sấy (Binder, Đức)
- Nồi khử trùng autoclave (Sturdy industrial Co, Ltd, Đài Loan) - Lò vi sóng phá mẫu (LG, Hàn Quốc)
- Thiết bị đo lưu biến (CR-500DX, Nhật) - Thiết bị chưng cất đạm (Velt, Đức)
2.1.5. Hóa chất, môi trường và thuốc thử
a) Môi trường tăng sinh APW (Alkaline Peptone Water)
Pepton : 10 g Natri clorua (NaCl) : 30 g Nước cất : 1 lít pH = 8,5 ± 0,2
Hòa tan các thành phần, chỉnh pH theo yêu cầu rồi chia vào các bình tam giác dung tích 100 ml, mỗi bình 20 ml. Đậy nút bông, giấy bạc rồi đem hấp ở
1210C trong 10 phút. Việc bao gói phải thật kín và cẩn thận để sau khi khử trùng không bị bật nút rất dễ nhiễm vi sinh vật, tránh mấtnước và làm pH thay đổi.
b) Môi trường phân lập MRS (Lactobaccillus MRS Broth)
Thành phần môi trường tổng hợp MRS Broth
Hòa tan 55,15 g môi trường MRS Broth tổng hợp với 1000 ml nước cất, đem hấp khử trùng ở 1210C trong thời gian 15 phút. Nếu pha môi trường MRS đặc thì bổ sung thêm 20 g/l môi trường, hòa tan đều thạch agar rồi phân phối vào các bình tam giác.
c) Môi trường nuôi cấy TSB (Trypton Soy Broth)
Hòa tan 30 g môi trường TSB tổng hợp trong 1000 ml nước cất, chuẩn pH, sau đó đem rót môi trường vào các bình tam giác, làm nút bông và giấy bạc, hấp khử trùng ở
1210C trong thời gian 15 phút.
d) Môi trường thử hoạt tính TSA (Tryptone Soya Agar)
Môi trường TSA được pha từ môi trường TSB có bổ sung thêm 1 % thạch agar.
e) Môi trường nuôi cấy XLD (Xylose Lysine Desoxycholate Agar)
Đun sôi môi trường, không hấp, để nguội đến 500C rồi đổ đĩa và không giữ quá 1 ngày.
f) Môi trường nuôi cấy RV (Rappaport Vassiliadis)
Môi trường cơ bản phải được chuẩn bị cùng ngày kết hợp các thành phần để có môi trường hoàn chỉnh. Vì MgCl2 hút ẩm rất mạnh và nồng độ chính xác của MgCl2 trong môi trường RV là rất quan trọng nên hòa tan hết lượng MgCl2 trong lọ mới cho vào nước cất. Dung dịch MgCl2 giữ trong chai tối màu ở nhiệt độ phòng đến 1 năm. Dung dịch Malachite green oxalate giữ trong chai tối màu ở nhiệt độ phòng đến 6 tháng.
Phân phối 10 ml môi trường hoàn chỉnh vào các ống nghiệm. Hấp khử trùng ở 1150C, 15 phút. pH cuối 5,5 ± 0,2. Giữ trong tủ lạnh và sử dụng trong vòng 1 tháng. Môi trường này nên chuẩn bị từng thành phần riêng biệt. Không nên sử dụng môi trường thương mại dạng khô. Môi trường thương mại dạng khô cũng giữ trong tủ lạnh (4-80C), thời gian 1 tháng.
g) Dung dịch nước muối sinh lý
Hoà tan 8,5 g NaCl trong 1 lít nước cất. Hấp khử trùng ở nhiệt độ 1210C trong 15 phút rồi để nguội.
h) Dung dịch xanh methylen
Dung dịch xanh methylen ở nồng độ 0,4 % (w/v) đã được sử dụng để tạo màu cho môi trường trong các thí nghiệm thử vòng kháng khuẩn.
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Hoạt hóa và nuôi cấy các chủng vi khuẩn lactic sinh bacteriocin
Hình 2.2. Sơ đồ quy trình hoạt hóa và nuôi cấy vi khuẩn
Hoạt hóa
Mục đích: ổn định đặc tính sinh học của vi khuẩn và tùy mục đích nghiên cứu mà ta hoạt hóa ở một tỉ lệ khác nhau.
Các chủng vi khuẩn được hoạt hóa trên môi trường tương thích với mỗi chủng. Nếu hoạt hóa chủng từ giống gốc trong ống eppendorf được giữ trong tủ đông sâu thì trước khi sử dụng giống ta phải lấy ống giống từ tủ đông sâu để vào
Chủng gốc Hoạt hóaở 370C, 20 giờ Ủ ở 37oC hoặc lắc trong 15-20 giờ Đo OD600 Nuôi cấy Ủ ở 37oC trong 12-15 giờ
ngăn mát của tủ lạnh (4oC) khoảng 15 phút để tránh hiện tượng sốc nhiệt gây ảnh hưởng tới các đặc tính sinh học của vi khuẩn.
Ủ dịch hoạt hóa trong tủ ấm 370C. Thời gian hoạt hóa là khoảng từ 15-20 giờ là tốt nhất. Nuôi cấy chủng vi khuẩn sang môi trường mới khi chúng đang sinh trưởng ở pha log, trong thời gian này tế bào vi khuẩn đang ở trạng thái sinh lý tốt nhất.
Nuôi cấy
Mục đích: ổn định hoạt tính sinh học, tăng sinh khối và khả năng sinh tổng hợp các chất.
Sau khi hoạt hóa ta hút dịch vi khuẩn đã hoạt hóa vào môi trường nuôi cấy. Đối với các chủng vi khuẩn lactic trước khi chuyển sang môi trường nuôi cấy thì ta tiến hành đo OD600 để xác định khả năng sinh trưởng của vi khuẩn trên môi trường nuôi cấy. Từ kết quả OD600 xác định tương đối lượng dịch vi khuẩn lactic đã hoạt hóa đưa vào môi trường nuôi cấy tương ứng, dịch vi khuẩn khi bắt đầu nuôi cấy có OD600 bằng khoảng 0,06. Ủ dịch vi khuẩn trong tủ ấm ở 37oC trong thời gian 12-15 giờ, sau đó ly tâm lấy dịch bacteriocin thô để xác định hoạt tính, vì trong thời gian này bacteriocin được sinh ra là nhiều nhất [4].
2.2.2. Thu nhận dịch bacteriocin thô
Dịch vi khuẩn lactic T8 đã nuôi cấy được ly tâm lạnh ở 40C, 7000 vòng/phút, trong 15 phút. Sau ly tâm thu dịch trong phía trên là dịch bacteriocin thô và loại bỏ phần cặn là các tế bào vi khuẩn lactic kết tủa phía dưới.
2.2.3. Xác định hoạt độ bacteriocin
Mục đích: Thử tính đối kháng của vi khuẩn lactic đối với các vi khuẩn gây bệnh thường gặp trong thực phẩm.
Nguyên lý: Sau khi nuôi dịch lỏng vi khuẩn lactic trong 16-20 giờ, tiến hành ly tâm thu dịch bacteriocin thô và chuẩn độ để loại bỏ tác dụng của axit lactic do vi khuẩn lactic tiết ra có trong dịch, sau đó tiến hành thử hoạt tính với các chủng chỉ thị. Hoạt tính kháng khuẩn được xác định bằng phương pháp khuyếch tán trên thạch. Ở phương pháp này, chủng vi khuẩn thử nghiệm và chủng chỉ thị cùng được
nuôi trên một môi trường, và tính đối kháng thể hiện ở việc chất ức chế của chủng thử nghiệm khuyếch tán vào môi trường và gây ức chế chủng chỉ thị. Sử dụng đĩa thạch đã nuôi cấy chủng chỉ thị, sau đó tạo giếng trên thạch bằng cách đục lỗ, tra dịch của chủng thử nghiệm đã được ly tâm trước đó và ủ ở nhiệt độ thích hợp. Phương pháp này thích hợp đối với việc kiểm tra những khuẩn lạc riêng rẽ và áp dụng rộng rãi trong nghiên cứu về mặt di truyền.
Phương pháp: Sử dụng phương pháp khoan lỗ thạch để xác định hoạt tính bacteriocin theo Daeschel (1992).
- Các bước tiến hành:
Hút dịch bacteriocin thô và đo pH ban đầu, sau đó mới tiến hành chuẩn độ pH bằng dung dịch NaOH 2N để đưa về pH = 7. Bước này nhằm mục đích loại bỏ sự ảnh hưởng của axit lactic tiết ra có thể gây nhầm lẫn trong việc xác định hoạt tính của bacteriocin do vi khuẩn lactic tiết ra.
Sau đó tiến hành thử hoạt tính bằng phương pháp khếch tán trên thạch. Phương pháp này dựa trên khả năng đối kháng giữa vi sinh vật kiểm định và vi sinh vật chỉ thị. Đun nóng môi trường TSA với lượng agar là 10 g/l, có pha thêm chất màu methylen blue (2 ml/200 ml thạch mềm TSA) và làm nguội cho đến khoảng 35-380C thì hút 20 µl dịch vi khuẩn chỉ thị vào, lắc đều. Đổ 20 ml môi trường vào đĩa petri, ta để thạch đông hoàn toàn thì đục lỗ thạch. Hút 200 µl dịch bacteriocin thô tra vào lỗ thạch. Ủ đĩa thạch ở 370C trong 16-24 giờ, sau đó kiểm tra sự tạo thành vòng kháng khuẩn và đo kích thước vòng kháng.
- Đo hoạt độ theo đường kính vòng kháng khuẩn:
Đường kính vòng kháng = D - d
Trong đó: d là đường kính lỗ thạch
D là đường kính vòng kháng
- Đo hoạt độ theo đơn vị AU/ml:
Hoạt độ: A = (1000/ d) * D (Parente và cộng sự, 1994a)
Trong đó: d (dose) là liều lượng chất cần xác định hoạt tính cho vào lỗ thạch
2.2.4. Xác định độ bền của bacteriocin
a) Xác định độ bền của dịch bacteriocin thô đối với các enzyme protease
(proteinase K, α-chymotrypsin)
Mục đích: Để kiểm tra bản chất của chất kháng khuẩn của dịch bacteriocin
thô của vi khuẩn lactic có phải là protein không.
Nguyên lý: Bacteriocin có bản chất protein nên dưới tác dụng của enzyme protease (proteinase K, enzyme α-chymotrypsin và một số enzyme khác như trypsin, lipase sẽ làm bacteriocin bị thủy phân, mất hoạt tính.
Bố trí thí nghiệm:
Sử dụng dịch bacteriocin thô đã ly tâm và chuẩn độ pH bằng NaOH 2N hoặc bằng HCl 2N (các thao tác chuẩn bị dịch đã nêu rõ trước đó).
Enzym proteinase K và α-chymotrypsin được pha sẵn trước đó với nồng độ 20 mg/ml cần được bảo quản lạnh, khi cần dùng thì mới lấy ra hút nhanh cho vào dịch bacteriocin thô. Tỷ lệ enzyme / dịch bacteriocin của vi khuẩn phải đạt nồng độ cuối cùng là 1 mg/1 ml.
Sau khi cho enzyme vào thì đem ủ trong bể ổ nhiệt ở nhiệt độ 500C trong 6 giờ, làm lạnh nhanh ở 00C trong 10 phút để bất hoạt enzyme.
Song song với việc chuẩn bị mẫu xử lý enzyme, cần chuẩn bị thêm 1 mẫu đối chứng cũng đem xử lý ở cùng điều kiện nhiệt độ, thời gian, thể tích dịch như mẫu enzyme và 1 mẫu bình thường, là dịch không đem xử lý enzyme, để ở nhiệt độ phòng để dễ dàng giúp ta nhận biết được khả năng kháng khuẩn của nó qua kích thước vòng kháng. Đối với các mẫu dịch bacteriocin của vi khuẩn đem đi xử lý enzyme α-chymotrypsin được pha ở nồng độ 2X thì mẫu đối chứng nên bổ sung thêm 1 lượng nước cất bằng với lượng dịch bacteriocin trước khi đem đi xử lý, mẫu bình thường tỷ lệ nước cất: dịch bacteriocin thô cũng là 1:1 nhưng không đem đi xử lý mà để ở nhiệt độ phòng.
Sau khi xử lý xong, tiến hành thử enzyme cũng bằng phương pháp khuếch tán trên thạch. Đun nóng môi trường TSA có bổ sung agar (10 g/ l) có pha thêm chất màu methylen blue (2 ml/200 ml thạch mềm TSB) và làm nguội cho đến khoảng 35-380C thì hút 420 µl dịch vi khuẩn chỉ thị. Đổ 20 ml môi trường vào đĩa petri, để thạch đông hoàn toàn thì đục lỗ thạch. Hút 200 µl dịch bacteriocin thô đã được xử lý bởi enzym vào lỗ thạch. Ủ đĩa ở 370C trong 16-24 giờ thì kiểm tra sự tạo thành vòng kháng khuẩn và đo kích thước vòng kháng.
b) Xác định độ bền nhiệt của dịch bacteriocin thô
Mục đích: Khảo sát khả năng bền nhiệt của dịch bacteriocin thô ở những nhiệt độ khác nhau, từ đó giúp cho việc tách chiết và thu dịch bacteriocin hiệu quả hơn và đưa ra biện pháp xử lý phù hợp với việc sử dụng dịch bacteriocin bảo quản thực phẩm sau này.
Nguyên tắc:
Bacteriocin có bản chất là protein. Dưới tác động ở những nhiệt độ khác nhau có thể làm ảnh hưởng đến hoạt tính của bacteriocin. Hoạt tính này có thể mất đi ở nhiệt độ quá cao do cấu trúc của protein bị biến đổi, protein có thể bị biến tính.
Bố trí thí nghiệm:
Chuẩn bị dịch bacteriocin thô. Hút lần lượt ra các ống nghiệm đã sấy tiệt trùng, mỗi ống nghiệm 5ml đem đi xử lý ở các nhiệt độ sau: 600C, 1000C ủ ở bể ổn nhiệt trong 30 phút, 1210C ở nồi hấp trong vòng 15 phút.
Cần chuẩn bị thêm 1 mẫu đối chứng không xử lý nhiệt độ cao.
Sau khi xử lý xong thì tiến hành thử độ bền nhiệt bằng phương pháp khuếch tán trên thạch có chứa vi khuẩn chỉ thị. Nhỏ 200 µl dịch bacteriocin đã xử lý nhiệt và mẫu đối chứng vào mỗi giếng. Sau đó nuôi vi khuẩn chỉ thị trong tủ ấm ở 370C và đọc kết quả sau 24 giờ.
c) Xác định độ bền của dịch bacteriocin thô trong các điều kiện pH
Mục đích: Kiểm tra hoạt tính của bacteriocin có bị ảnh hưởng bởi tác nhân axit hay bazơ hay không.
Tiến hành:
Chuẩn bị 60 ml dịch bacteriocin thô, hút lần lượt ra các ống nghiệm sạch dùng để chuẩn độ pH ở các thang 2, 4, 6, 7, 8, 10, 12 bằng dung dịch NaOH 2N và HCl 2N. Chuẩn độ xong hút 1 ml dịch sang các ống eppendorf và đem để tủ ấm ở 370C trong vòng 15 phút. Sau đó, chuẩn độ tất cả các ống về pH bằng 7.
Đồng thời chuẩn bị mẫu đối chứng, dịch sử dụng là môi trường MRS/TSB. Thao tác xử lý tương tự như xử lý dịch bacteriocin ở trên.
Sau khi xử lý xong, hút 200µl dịch xử lý cho vào mỗi lỗ thạch trong các đĩa có chứa vi khuẩn chỉ thị. Mỗi đĩa lặp lại 3 lần. Đặt các đĩa thạch chứa vi khuẩn chỉ thị trong tủ ấm ở 370C, trong vòng 16-24 giờ thì đọc kết quả.
Ghi chú: Việc xác định khoảng pH và nhiệt độ để khảo sát độ bền của bacteriocin được dựa vào các nghiên cứu về những đặc tính của bacteriocin (Torodov, Dicks, 2005).
2.2.5. Đánh giá tác động của bacteriocin trên cá giò trong quá trình bảo quản
Mục đích: Đánh giá sự ảnh hưởng của dịch bacteriocin thô lên nguyên liệu cá giò thông qua 3 chỉ tiêu chất lượng: chỉ tiêu cảm quan, chỉ tiêu hóa học (dinh dưỡng), chỉ tiêu vi sinh vật (an toàn vệ sinh thực phẩm).
a) Đánh giá chất lượng cảm quan của cá giò tươi nguyên liệu
- Các mẫu cá thí nghiệm sau thời gian bảo quản 1, 3, 5, 7 ngày bằng dịch bacteriocin thô ở nhiệt độ 0 - 4 0C được sử dụng để Hội đồng cảm quan đánh giá. Các chỉ tiêu đánh giá theo TCVN 3215-79.
- Song song với việc đánh giá cảm quan, các mẫu cá tương tự được lấy để đo độ đàn hồi của da cá, cơ thịt cá trên máy đo lưu biến.
Đánh giá cảm quan là kỹ thuật sử dụng các cơ quan cảm giác của con người để nhận biết, mô tả và định lượng các tính chất cảm quan của một sản phẩm như màu sắc, hình thái, mùi, vị và cấu trúc.
Để đánh giá chất lượng cá giò, chúng tôi sử dụng phương pháp cho điểm được quy định theo Tiêu chuẩn Việt Nam – TCVN (3215 - 79). Tiêu chuẩn này sử dụng hệ 20 điểm xây dựng trên một thang thống nhất có 6 bậc (từ 0 đến 5) trong đó điểm 0 ứng với chất lượng sản phẩm “bị hỏng”, còn từ điểm 1 đến điểm 5 ứng với mức khuyết tật giảm dần. Ở điểm 5 sản phẩm coi như không có sai lỗi và khuyết tật nào, trong tính chất đang xét, sản phẩm có tính tốt đặc trưng và rõ rệt cho chỉ tiêu đó. Tổng hệ số trọng lượng của tất cả các chỉ tiêu được đánh giá cho một sản phẩm bằng 4.
Khi đánh giá mỗi kiểm nghiệm viên căn cứ kết quả ghi nhận được, đối chiếu với bảng mô tả các chỉ tiêu của sản phẩm (Bảng 2.2 – 2.5, Phụ lục) và dùng