Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam

L ỜI CẢM ƠN

1.2.2. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam

Hiện nay ở nước ta việc nghiên cứu về bacteriocin do vi khuẩn lactic sinh tổng hợp nên đã và đang được nhiều nhà khoa học quan tâm. Tuy nhiên các nghiên cứu về ứng dụng của bacteriocin còn ít và chưa thu được những kết quả khả quan.

Nguyễn Thị Hoài Hà và cộng sự tại Trung tâm Công nghệ sinh học Đại học Quốc gia Hà Nội đã nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp bacteriocin của chủng

Lactobacillus plantarum L24 phân lập từ nước dưa. Chủng vi khuẩn lactic vừa có khả năng sinh axit lactic, vừa có khả năng sinh bacteriocin II, một protein kháng khuẩn có trọnglượng phân tử 10-30 kDa.

Năm 2002, tác giả Lê Thanh Mai đã thành công trong việc nghiên cứu quy trình muối chua cây nha đam. Các thí nghiệm tiến hành dựa trên 2 phương pháp: lên men có bổ sung giống Lactobacillus plantarum và lên men không bổ sung giống. Kết quả cho thấy muối chua có bổ sung giống cho thành phẩm có chất lượng tốt hơn và đồng đều hơn.

Ngoài ra còn rất nhiều các nghiên cứu ứng dụng của vi khuẩn lactic vào các sản phẩm thực phẩm làm cho thực phẩm có tính ổn định và về mặt cảm quan có nhiều ưu việt hơn là sản phẩm thực phẩm lên men lactic tự nhiên. Có được ưu điểm này là do ngoài những tính chất ưu việt vi khuẩn lactic còn có khả năng sinh tổng hợp bacteriocin, một chất bảo quản thực phẩm.

Năm 2006, Phạm Thùy Linh nghiên cứu khả năng tạo chất diệt khuẩn enterocin P tái tổ hợp nhằm ứng dụng trong bảo quản thực phẩm. Đây là nghiên cứu đầu tiên về tạo bacteriocin tái tổ hợp một cách có hệ thống tại Việt Nam. Sản phẩm của nghiên cứu này là protein Hisent P tái tổ hợp có hoạt tính kháng khuẩn và các đặc tính sinh hóa tương đồng với enterocin P tự nhiên, bước đầu đã có khả năng kéo dài thời gian bảo quản thực phẩm và có thể tiếp tục nghiên cứu phát triển làm phụ gia sinh học dùng cho bảo quản.

Năm 2008, Nguyễn Thúy Hương đã nghiên cứu việc cố định tế bào vi khuẩn Lactococcus lactic trên chất mang cellulose vi khuẩn (Bacterial Cellulose - BC) để ứng dụng lên men thu nhận bacteriocin. Kết quả cho thấy: hiệu quả sử dụng chế phẩm tế bào vi khuẩn cố định trên BC để lên men thu nhận bacteriocin khá cao, có thể tái sử dụng 9 - 10 lần mà vẫn đảm bảo về mặt thời gian lên men, số lượng và chất lượng bacteriocin so với đối chứng. Kết quả thu được cũng góp phần thăm dò 2 ứng dụng mới của cellulose vi khuẩn (BC): sử dụng BC làm chất mang trong kỹ thuật cố định tế bào vi sinh vật và sử dụng màng mỏng BC làm màng bao thực phẩm.

Công trình nghiên cứu của tác giả Nguyễn Hoài Hương và cộng sự (2010) đã sử dụng bacteriocin trong quá trình làm nem chua. Kết quả đã kéo thời gian bảo quản tránh tình trạng bị chảy nước và góp phần tạo hương vị cho nem chua.

Đặc biệt cũng có một số nghiên cứu ứng dụng bacteriocin trong lĩnh vực thủy sản như bổ sung vào thức ăn cho cá, bảo quản tôm đông lạnh trong dung dịch muối NaCl 3-6% có bổ sung nisin ở nhiệt độ thấp để tiêu diệt Listeria monocytogene. Khi so sánh dùng phương pháp bảo quản này với các phương pháp

khác thì thấy thời gian bảo quản bằng với thời gian khi dùng benzoate hay sorbate để bảo quản. Tuy nhiên, phương pháp bảo quản này rất an toàn cho sức khỏe người tiêu dùng, đảm bảo chất lượng sản phẩm. Dù vậy, cho đến nay, ứng dụng bacteriocin trong việc bảo quản các loại thủy sản, đặc biệt là cá biển, chưa có nhiều nghiên cứu đầy đủ về vấn đề này. Chính vì thế, đề tài này đã được triển khai nghiên cứu thực nghiệm nhằm tìm ra và khẳng định một giải pháp mới cho việc bảo quản nguyên liệu thủy sản tươi.

CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1.1. Mẫu cá giò

Cá giò tươi sống có chiều dài thân 60-70 cm, trọng lượng 5-7 kg, được thu mua ở các đìa nuôi tại Lương Sơn – Nha Trang – Khánh Hòa vào tháng 3-5/ 2010. Sau khi thu hoạch, cá giò được bảo quản bằng đá xay ở 0⁰C trong thùng xốp cách nhiệt và được đưa ngay về phòng thí nghiệm để nghiên cứu.

Sử dụng 6 mẫu cá cho một lần thí nghiệm. Lặp lại thí nghiệm ba lần.

2.1.2. Chủng vi khuẩn lactic T8

Chủng vi khuẩn lactic được sử dụng để thu bacteriocin dùng trong tất cả các thí nghiệm là chủng vi khuẩn lactic T8, được lấy từ bộ sưu tập các chủng vi sinh vật tại phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học, trường Đại học Nha Trang (Nguyễn Văn Duy, Lưu Thị Thúy, 2011). Chủng vi khuẩn này được bảo quản trong glycerol 20-30% ở nhiệt độ -80^oC. Chủng vi khuẩn lactic T8 được nuôi cấy trên môi trường MRS (De Man, Rogosa, Sharpe), ở 37^oC, pH 6,2 - 6,8.

Hình 2.1. Khuẩn lạc của vi khuẩn lactic T8 trên môi trường MRS 2.1.3. Chủng vi khuẩn chỉ thị

Các chủngSalmonella Sal 1, Bacillus B1.1 và Vibrio C1 được lấy từ bộ sưu tập vi sinh vật của phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học, trường Đại học Nha

Trang. Chủng Salmonella Sal 1 được nuôi cấy trên môi trường RV, ở pH 5,2 – 5,7 và nhiệt độ 37⁰C trong 7-10 giờ. Chủng Bacillus B1.1 được nuôi cấy trên môi trường TSB, pH 7,3 ± 0,2, lắc 180 vòng/phút trong 7 – 8 giờ. Chủng Vibrio C1 được nuôi cấy tương tự như chủng Bacillus B1.1, đem lắc 150 vòng/ phút.

Các chủng vi khuẩn được bảo quản trong dung dịch glycerol 20 - 30%, ở - 80⁰C. Các chủng chỉ thị được hoạt hóa trước khi thử đối kháng bằng cách lấy 1 ống giống từ tủ bảo quản chủng, sau đó hút 1 ml dịch vi khuẩn đem nuôi cấy ở những điều kiện thích hợp trên môi trường nuôi trong vòng 16 – 18 giờ.

2.1.4. Thiết bị chuyên dụng

- Máy ly tâm (Eppendorf Centrifuge 5417R, Mỹ) - Tủ lạnh (NANO Silver, Việt Nam)

- Kính hiển vi 3 mắt ngắm có camera và máy tính (Motic BA 300, Mỹ) - Máy định lượng protein bằng quang phổ hấp thụ phân tử (UV/VIS) (Carry 100 Bio, Úc)

- Máy lắc (GFL 3005, Đức)

- Tủ cấy (Telstar AV 100, OSI Co, Ltd, Tây Ban Nha) - Tủ sấy (Binder, Đức)

- Nồi khử trùng autoclave (Sturdy industrial Co, Ltd, Đài Loan) - Lò vi sóng phá mẫu (LG, Hàn Quốc)

- Thiết bị đo lưu biến (CR-500DX, Nhật) - Thiết bị chưng cất đạm (Velt, Đức)

2.1.5. Hóa chất, môi trường và thuốc thử

a) Môi trường tăng sinh APW (Alkaline Peptone Water)

Pepton : 10 g Natri clorua (NaCl) : 30 g Nước cất : 1 lít pH = 8,5 ± 0,2

Hòa tan các thành phần, chỉnh pH theo yêu cầu rồi chia vào các bình tam giác dung tích 100 ml, mỗi bình 20 ml. Đậy nút bông, giấy bạc rồi đem hấp ở

121⁰C trong 10 phút. Việc bao gói phải thật kín và cẩn thận để sau khi khử trùng không bị bật nút rất dễ nhiễm vi sinh vật, tránh mấtnước và làm pH thay đổi.

b) Môi trường phân lập MRS (Lactobaccillus MRS Broth)

Thành phần môi trường tổng hợp MRS Broth

Hòa tan 55,15 g môi trường MRS Broth tổng hợp với 1000 ml nước cất, đem hấp khử trùng ở 121⁰C trong thời gian 15 phút. Nếu pha môi trường MRS đặc thì bổ sung thêm 20 g/l môi trường, hòa tan đều thạch agar rồi phân phối vào các bình tam giác.

c) Môi trường nuôi cấy TSB (Trypton Soy Broth)

Hòa tan 30 g môi trường TSB tổng hợp trong 1000 ml nước cất, chuẩn pH, sau đó đem rót môi trường vào các bình tam giác, làm nút bông và giấy bạc, hấp khử trùng ở

121⁰C trong thời gian 15 phút.

d) Môi trường thử hoạt tính TSA (Tryptone Soya Agar)

Môi trường TSA được pha từ môi trường TSB có bổ sung thêm 1 % thạch agar.

e) Môi trường nuôi cấy XLD (Xylose Lysine Desoxycholate Agar)

Đun sôi môi trường, không hấp, để nguội đến 50⁰C rồi đổ đĩa và không giữ quá 1 ngày.

f) Môi trường nuôi cấy RV (Rappaport Vassiliadis)

Môi trường cơ bản phải được chuẩn bị cùng ngày kết hợp các thành phần để có môi trường hoàn chỉnh. Vì MgCl2 hút ẩm rất mạnh và nồng độ chính xác của MgCl2 trong môi trường RV là rất quan trọng nên hòa tan hết lượng MgCl2 trong lọ mới cho vào nước cất. Dung dịch MgCl2 giữ trong chai tối màu ở nhiệt độ phòng đến 1 năm. Dung dịch Malachite green oxalate giữ trong chai tối màu ở nhiệt độ phòng đến 6 tháng.

Phân phối 10 ml môi trường hoàn chỉnh vào các ống nghiệm. Hấp khử trùng ở 115⁰C, 15 phút. pH cuối 5,5 ± 0,2. Giữ trong tủ lạnh và sử dụng trong vòng 1 tháng. Môi trường này nên chuẩn bị từng thành phần riêng biệt. Không nên sử dụng môi trường thương mại dạng khô. Môi trường thương mại dạng khô cũng giữ trong tủ lạnh (4-8⁰C), thời gian 1 tháng.

g) Dung dịch nước muối sinh lý

Hoà tan 8,5 g NaCl trong 1 lít nước cất. Hấp khử trùng ở nhiệt độ 121⁰C trong 15 phút rồi để nguội.

h) Dung dịch xanh methylen

Dung dịch xanh methylen ở nồng độ 0,4 % (w/v) đã được sử dụng để tạo màu cho môi trường trong các thí nghiệm thử vòng kháng khuẩn.

2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1. Hoạt hóa và nuôi cấy các chủng vi khuẩn lactic sinh bacteriocin

Hình 2.2. Sơ đồ quy trình hoạt hóa và nuôi cấy vi khuẩn

 Hoạt hóa

Mục đích: ổn định đặc tính sinh học của vi khuẩn và tùy mục đích nghiên cứu mà ta hoạt hóa ở một tỉ lệ khác nhau.

Các chủng vi khuẩn được hoạt hóa trên môi trường tương thích với mỗi chủng. Nếu hoạt hóa chủng từ giống gốc trong ống eppendorf được giữ trong tủ đông sâu thì trước khi sử dụng giống ta phải lấy ống giống từ tủ đông sâu để vào

Chủng gốc Hoạt hóaở 37⁰C, 20 giờ Ủ ở 37^oC hoặc lắc trong 15-20 giờ Đo OD600 Nuôi cấy Ủ ở 37^oC trong 12-15 giờ

ngăn mát của tủ lạnh (4^oC) khoảng 15 phút để tránh hiện tượng sốc nhiệt gây ảnh hưởng tới các đặc tính sinh học của vi khuẩn.

Ủ dịch hoạt hóa trong tủ ấm 37⁰C. Thời gian hoạt hóa là khoảng từ 15-20 giờ là tốt nhất. Nuôi cấy chủng vi khuẩn sang môi trường mới khi chúng đang sinh trưởng ở pha log, trong thời gian này tế bào vi khuẩn đang ở trạng thái sinh lý tốt nhất.

 Nuôi cấy

Mục đích: ổn định hoạt tính sinh học, tăng sinh khối và khả năng sinh tổng hợp các chất.

Sau khi hoạt hóa ta hút dịch vi khuẩn đã hoạt hóa vào môi trường nuôi cấy. Đối với các chủng vi khuẩn lactic trước khi chuyển sang môi trường nuôi cấy thì ta tiến hành đo OD600 để xác định khả năng sinh trưởng của vi khuẩn trên môi trường nuôi cấy. Từ kết quả OD600 xác định tương đối lượng dịch vi khuẩn lactic đã hoạt hóa đưa vào môi trường nuôi cấy tương ứng, dịch vi khuẩn khi bắt đầu nuôi cấy có OD600 bằng khoảng 0,06. Ủ dịch vi khuẩn trong tủ ấm ở 37^oC trong thời gian 12-15 giờ, sau đó ly tâm lấy dịch bacteriocin thô để xác định hoạt tính, vì trong thời gian này bacteriocin được sinh ra là nhiều nhất [4].

2.2.2. Thu nhận dịch bacteriocin thô

Dịch vi khuẩn lactic T8 đã nuôi cấy được ly tâm lạnh ở 4⁰C, 7000 vòng/phút, trong 15 phút. Sau ly tâm thu dịch trong phía trên là dịch bacteriocin thô và loại bỏ phần cặn là các tế bào vi khuẩn lactic kết tủa phía dưới.

2.2.3. Xác định hoạt độ bacteriocin

Mục đích: Thử tính đối kháng của vi khuẩn lactic đối với các vi khuẩn gây bệnh thường gặp trong thực phẩm.

Nguyên lý: Sau khi nuôi dịch lỏng vi khuẩn lactic trong 16-20 giờ, tiến hành ly tâm thu dịch bacteriocin thô và chuẩn độ để loại bỏ tác dụng của axit lactic do vi khuẩn lactic tiết ra có trong dịch, sau đó tiến hành thử hoạt tính với các chủng chỉ thị. Hoạt tính kháng khuẩn được xác định bằng phương pháp khuyếch tán trên thạch. Ở phương pháp này, chủng vi khuẩn thử nghiệm và chủng chỉ thị cùng được

nuôi trên một môi trường, và tính đối kháng thể hiện ở việc chất ức chế của chủng thử nghiệm khuyếch tán vào môi trường và gây ức chế chủng chỉ thị. Sử dụng đĩa thạch đã nuôi cấy chủng chỉ thị, sau đó tạo giếng trên thạch bằng cách đục lỗ, tra dịch của chủng thử nghiệm đã được ly tâm trước đó và ủ ở nhiệt độ thích hợp. Phương pháp này thích hợp đối với việc kiểm tra những khuẩn lạc riêng rẽ và áp dụng rộng rãi trong nghiên cứu về mặt di truyền.

Phương pháp: Sử dụng phương pháp khoan lỗ thạch để xác định hoạt tính bacteriocin theo Daeschel (1992).

- Các bước tiến hành:

Hút dịch bacteriocin thô và đo pH ban đầu, sau đó mới tiến hành chuẩn độ pH bằng dung dịch NaOH 2N để đưa về pH = 7. Bước này nhằm mục đích loại bỏ sự ảnh hưởng của axit lactic tiết ra có thể gây nhầm lẫn trong việc xác định hoạt tính của bacteriocin do vi khuẩn lactic tiết ra.

Sau đó tiến hành thử hoạt tính bằng phương pháp khếch tán trên thạch. Phương pháp này dựa trên khả năng đối kháng giữa vi sinh vật kiểm định và vi sinh vật chỉ thị. Đun nóng môi trường TSA với lượng agar là 10 g/l, có pha thêm chất màu methylen blue (2 ml/200 ml thạch mềm TSA) và làm nguội cho đến khoảng 35-38⁰C thì hút 20 µl dịch vi khuẩn chỉ thị vào, lắc đều. Đổ 20 ml môi trường vào đĩa petri, ta để thạch đông hoàn toàn thì đục lỗ thạch. Hút 200 µl dịch bacteriocin thô tra vào lỗ thạch. Ủ đĩa thạch ở 37⁰C trong 16-24 giờ, sau đó kiểm tra sự tạo thành vòng kháng khuẩn và đo kích thước vòng kháng.

- Đo hoạt độ theo đường kính vòng kháng khuẩn:

Đường kính vòng kháng = D - d

Trong đó: d là đường kính lỗ thạch

D là đường kính vòng kháng

- Đo hoạt độ theo đơn vị AU/ml:

Hoạt độ: A = (1000/ d) * D (Parente và cộng sự, 1994a)

Trong đó: d (dose) là liều lượng chất cần xác định hoạt tính cho vào lỗ thạch

2.2.4. Xác định độ bền của bacteriocin

a) Xác định độ bền của dịch bacteriocin thô đối với các enzyme protease

(proteinase K, α-chymotrypsin)

Mục đích: Để kiểm tra bản chất của chất kháng khuẩn của dịch bacteriocin

thô của vi khuẩn lactic có phải là protein không.

Nguyên lý: Bacteriocin có bản chất protein nên dưới tác dụng của enzyme protease (proteinase K, enzyme α-chymotrypsin và một số enzyme khác như trypsin, lipase sẽ làm bacteriocin bị thủy phân, mất hoạt tính.

Bố trí thí nghiệm:

Sử dụng dịch bacteriocin thô đã ly tâm và chuẩn độ pH bằng NaOH 2N hoặc bằng HCl 2N (các thao tác chuẩn bị dịch đã nêu rõ trước đó).

Enzym proteinase K và α-chymotrypsin được pha sẵn trước đó với nồng độ 20 mg/ml cần được bảo quản lạnh, khi cần dùng thì mới lấy ra hút nhanh cho vào dịch bacteriocin thô. Tỷ lệ enzyme / dịch bacteriocin của vi khuẩn phải đạt nồng độ cuối cùng là 1 mg/1 ml.

Sau khi cho enzyme vào thì đem ủ trong bể ổ nhiệt ở nhiệt độ 50⁰C trong 6 giờ, làm lạnh nhanh ở 0⁰C trong 10 phút để bất hoạt enzyme.

Song song với việc chuẩn bị mẫu xử lý enzyme, cần chuẩn bị thêm 1 mẫu đối chứng cũng đem xử lý ở cùng điều kiện nhiệt độ, thời gian, thể tích dịch như mẫu enzyme và 1 mẫu bình thường, là dịch không đem xử lý enzyme, để ở nhiệt độ phòng để dễ dàng giúp ta nhận biết được khả năng kháng khuẩn của nó qua kích thước vòng kháng. Đối với các mẫu dịch bacteriocin của vi khuẩn đem đi xử lý enzyme α-chymotrypsin được pha ở nồng độ 2X thì mẫu đối chứng nên bổ sung thêm 1 lượng nước cất bằng với lượng dịch bacteriocin trước khi đem đi xử lý, mẫu bình thường tỷ lệ nước cất: dịch bacteriocin thô cũng là 1:1 nhưng không đem đi xử lý mà để ở nhiệt độ phòng.

Sau khi xử lý xong, tiến hành thử enzyme cũng bằng phương pháp khuếch tán trên thạch. Đun nóng môi trường TSA có bổ sung agar (10 g/ l) có pha thêm chất màu methylen blue (2 ml/200 ml thạch mềm TSB) và làm nguội cho đến khoảng 35-38⁰C thì hút 420 µl dịch vi khuẩn chỉ thị. Đổ 20 ml môi trường vào đĩa petri, để thạch đông hoàn toàn thì đục lỗ thạch. Hút 200 µl dịch bacteriocin thô đã được xử lý bởi enzym vào lỗ thạch. Ủ đĩa ở 37⁰C trong 16-24 giờ thì kiểm tra sự