1.3.1.1.Khái niệm chung về E[11][2]
E là chất xúc tác sinh học cĩ khả năng xúc tác với độ đặc hiệu cơ chất rất cao, cĩ bản chất là protein. Sự cĩ mặt của E trong các phản ứng hĩa học sẽ làm giảm năng lượng hoạt hĩa của phản ứng, làm tăng nhanh tốc độ phản ứng để đạt đến cân bằng phản ứng.
1.3.1.2. Nguồn nguyên liệu thu nhận E
E cĩ thể được thu nhận từ nhiều nguồn khác nhau
a/ Nguồn động vật [11]
Đây là nguồn E được phát hiện và thu nhận sớm nhất. Người ta đã thu nhận từ tụy tạng, màng nhầy dạ dày heo, dạ dày bê, gan, mật,…nhiều loại E như: trypsin, pepsin, rennin, ribonuclease, amylase,…
b/ Nguồn gốc thực vật [11]
Một số loại E được thu nhận từ thực vật như: Urease từ cây đậu rựa (Canavalin ensifirmis), bromelin từ cây họ dứa (Bromalaceae), papain từ nhựa đu đủ (Carica Papaya. L), hệ E β-amylase từ hạt ngũ cốc và một số loại củ chứa tinh bột nảy mầm.
c/ Nguồn vi sinh vật [17]
Đây là nguồn E phong phú nhất, cĩ ở hầu hết các lồi vi sinh vật như: nấm mốc, vi khuẩn, và một số loại nấm men. Người ta cĩ thể phân lập các giống vi sinh vật cĩ trong tự nhiên hoặc các giống đột biến cĩ lựa chọn theo hướng cĩ lợi nhất, chỉ tổng hợp ưu thế một loại E nhất định cần thiết nào đĩ.
So với việc thu nhận E từ các nguồn động vật, thực vật thì vi sinh vật vẫn là nguồn thích hợp nhất để sản xuất E ở quy mơ lớn dùng trong cơng nghệ và đời sống vì những lợi ích chính sau:
- Chủ động về nguồn giống và nguyên liệu nuơi cấy.
- Cĩ thể chủ động điều khiển sinh tổng hợp E dễ dàng theo định hướng sử dụng và tăng hiệu suất tổng thu hồi.
- Hiệu quả kinh tế cao hơn.
1.3.1.3. Phương pháp thu nhận E [17]
Các chế phẩm E được sử dụng ở các dạng khác nhau theo mức độ tinh khiết. Trong một số trường hợp, canh trường nuơi cấy vi sinh vật cĩ chứa E được sử dụng trực tiếp dưới dạng thơ khơng cần tách tạp chất như rượu, nước chấm,…Với những nghiên cứu khoa học, y học,… lại cần sử dụng chế phẩm E tinh khiết để xác định khối lượng phân tử, cấu trúc E và chữa bệnh.
a/ Thu dịch E [17]
Đối với các loại E nội bào, phải nghiền nát tế bào bằng nhiều cách như nghiền với cát, nghiền với vụn thủy tinh, tạo áp suất thẩm thấu cao từ muối, dung mơi hữu cơ,…hay kết tủa E bằng các chất điện ly thích hợp.
Đối với trường hợp E ngoại bào, cĩ thể tách sinh khối và cặn bã khỏi canh trường bằng cách lọc li tâm, lọc ép cĩ sử dụng tác nhân trợ kết tủa,…
b/ Thu nhận chế phẩm E thơ [11] [17]
Chế phẩm E thơ là chế phẩm E chưa được tinh chế cĩ nồng độ chất khơ thấp 4- 6g/l, cĩ thể chứa một vài loại E chủ yếu, một số loại protein khơng phải E, các chất ổn định và các tạp chất khác.
Sau khi thu dịch E từ canh trường nuơi cấy, bước đầu cơ đặc chân khơng ở nhiệt độ 40-450C để đạt nồng độ chất khơ 30-35g/l. Tiếp theo bổ sung thêm chất bảo quản như NaCl, glycerin, benzoat,…rồi sấy phun ở 1200C sẽ thu được chế phẩm E dạng bột. Cũng cĩ thể kết tủa E từ dung dịch sau cơ đặc bằng các dung mơi thích hợp như aceton, ethanol, …Sau khi li tâm tách kết tủa cĩ thể trộn thêm các chất ổn định rồi sấy khơ và nghiền mịn để thu được chế phẩm dạng bột.
E tinh khiết cĩ hoạt độ chung và hoạt độ riêng cao hơn nhiều so với chế phẩm ban đầu, nhưng quy trình làm sạch rất phức tạp, cơng phu và tốn kém. Việc tinh chế E cĩ thể tiến hành bằng nhiều phương pháp qua nhiều giai đoạn:
- Hịa tan chế phẩm E thơ vào nước hay dung dịch muối,…kết tủa trở lại bằng ethanol, aceton hay (NH4)2SO4 rồi dùng phương pháp thẩm tích, thẩm thấu ngược hay lọc gel để loại các muối vơ cơ.
- Tách E bằng phương pháp hấp phụ chọn lọc: cho dịch E chảy từ từ qua cột chất hấp phụ (thường là hydrat oxit-nhơm, silicagel), các E khác nhau sẽ được hấp phụ với khả năng khác nhau, sau đĩ dùng các dung dịch đệm thích hợp để chiết rút E ra khỏi cột.
- Tách E bằng phương pháp trao đổi ion: dựa vào sự trao đổi ion giữa E cĩ điện tích với các ion cùng dấu của nhựa (các dẫn xuất cellulose, …). Dùng dung dịch chất điện giải đẩy khỏi nhựa các E vừa liên kết với chúng. Như vậy, các E khác nhau sẽ được chiết ra khỏi cột theo từng phần chiết khác nhau, trong đĩ phần chiết chứa E cần thu với nồng độ cao nhất.
1.3.1.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tổng hợp E của vi sinh vật [20]
Ngồi yếu tố di truyền, quá trình sinh tổng hợp E cịn phụ thuộc nhiều vào các yếu tố sinh trưởng như nhiệt độ, pH, thành phần dinh dưỡng, cơ chất cảm ứng,…
a/ Giống vi sinh vật [20]
Chủng giống vi sinh vật thuần khiết, cĩ chất lượng tốt, đảm bảo được các yêu cầu của sản xuất phải cĩ những đặc tính cơ bản sau:
- Tạo sản phẩm chính năng suất cao, khơng sinh độc tố.
- Khả năng thích ứng và phát triển nhanh, thời gian thu sản phẩm ngắn và dễ dàng, hiệu suất thu hoạch cao.
- Luơn bảo tồn được các đặc tính di truyền quý trong quá trình sử dụng cũng như bảo quản.
b/ Ảnh hưởng của nhiệt độ [20]
Nhiệt độ ảnh hưởng đến sự phát triển, khả năng sinh tổng hợp E của vi sinh vật cũng như tính chất của E được tổng hợp. Nhiệt độ thích hợp cho các loại nấm mốc phát triển là 22-320C, vi khuẩn là 35-450C.
c/ Ảnh hưởng của pH mơi trường [11]
pH ban đầu của mơi trường thích hợp cho sự phát triển của các vi sinh vật khác nhau sẽ khơng giống nhau. Đối với nấm mốc, pH thích hợp trong khoảng 3.8-5.6 cịn đối với vi khuẩn là 6.2-7.4. Lưu ý trong quá trình nuơi cấy, tùy thành phần mơi trường và các sản phẩm trao đổi chất trong quá trình sống của vi sinh vật mà pH mơi trường cĩ thể chuyển sang acid hay kiềm.
d/ Ảnh hưởng của mơi trường nuơi cấy [11]
Đây là yếu tố ảnh hưởng trực tiếp đến hoạt động sống cũng như khả năng sinh tổng hợp E của vi sinh vật. Vì vậy, khi lựa chọn mơi trường cần chú ý đến cả thành phần định tính và định lượng sao cho quá trình sinh tổng hợp E mong muốn là cao nhất. Mơi trường nuơi vi sinh vật cần đảm bảo chứa đủ các chất C, N, H, O và các khống vi lượng khác như Fe, Mn, K,…
1.3.2. Giới thiệu về γ-amylase [37][13]
Hệ E amylase là một trong số các hệ E được sử dụng rộng rãi nhiều trong cơng nghiệp, y học và nhiều lĩnh vực khác. Hiện nay người ta biết cĩ 3 loại E amylase, trong đĩ, γ-amylase ở vị trí hàng đầu về hiệu lực thủy phân tinh bột và các sản phẩm trung gian.
1.3.2.1. Cấu trúc γ-amylase [37]
Cĩ tên hệ thống α-1,4-glucan-glucohydrolase, mã số EC 3.2.1.3, cịn được gọi là glucoamylase hay amyloglucosidase.
Hình 1.1: Cấu trúc khơng gian γ-amylase [38]
γ-amylase gồm 2 dạng cấu trúc khác nhau là γ-amylase I (thành phần cacbonhydrat chiếm khoảng 18%) và γ-amylase II (thành phần cacbonhydrat chiếm khoảng 10%), nhưng đều là những chuỗi glyco-protein. Trong phân tử γ-amylase cĩ chứa D-glucose, D-maltose, D-galactose giúp ổn định cấu trúc E, ngồi ra cịn giúp tạo liên kết với cơ chất là các phân tử polysaccharide, từ đĩ tạo thuận lợi cho quá trình thủy phân. Số lượng acid amin tham gia vào chuỗi polypeptid cấu tạo nên phân tử γ-amylase thu nhận từ nấm mốc Asp. niger và Asp.
awamori vào khoảng 650-700 acid amin. Trong khơng gian, phân tử γ-amylase được chia
làm ba vùng gồm: vùng SBD (Starch binding domain-vùng gắn kết với tinh bột), vùng CD (Catalyse domain-vùng xúc tác), vùng Linker cĩ độ dài khoảng 100Å giúp liên kết hai vùng trên lại với nhau.
1.3.2.2. Đặc tính [30]
γ-amylase là E ngoại bào, thuộc nhĩm exo-α-1,4 D-glucohydrolase, cĩ khả năng phân cắt nối α-1,4 lẫn nối α-1,6 glycoside để biến đổi 100% tinh bột đến sản phẩm cuối cùng là glucose. Đa số γ-amylase đều thuộc loại “chịu axit”, pHopt=3,5-5,5 t0opt= 50-600C, mất hoạt tính ở t > 700
C.
1.3.2.3. Nguồn nguyên liệu thu nhận [35][39]
Những chủng nấm mốc cĩ khả năng sinh tổng hợp cao γ-amylase được sử dụng trong cơng nghiệp là: Asp. niger, Asp. awamori, Asp. usamii, …Các vi sinh vật khác cũng cĩ tổng hợp γ-amylase nhưng lượng nhỏ hơn.
1.4. Enzyme cố định (immobilized enzyme) 1.4.1. Khái quát sự cố định E [19] 1.4.1. Khái quát sự cố định E [19]
Enzyme cố định (hay cịn được gọi là E khơng tan) là E cĩ sự tham gia hoạt động trong khơng gian bị giới hạn. Sự giới hạn hoạt động vốn linh hoạt của E bằng cách gắn nĩ vào một pha cách ly, tách rời khỏi pha lỏng tự do và ở đĩ nĩ vẫn cĩ khả năng tiếp xúc được với các phân tử cơ chất, chất hoạt hĩa (effector) hay chất ức chế (inhibitor). Pha gắn E thường khơng tan trong nước nhưng cũng cĩ thể là các polymer ưa nước.
1.4.2. Vật liệu cố định enzyme [19]
Khơng cĩ vật liệu cố định nào thích hợp cho tất cả các loại E và cũng khơng cĩ E nào thích hợp với tất cả các loại vật liệu cố định. Vì vậy, việc nghiên cứu đặc điểm, tính chất của vật liệu cố định là cần thiết cho sự chọn lựa phương pháp cố định E.
Vật liệu cố định E và tế bào cĩ thể được chia thành hai loại: vật liệu vơ cơ và vật liệu hữu cơ.
1.4.2.1. Vật liệu vơ cơ [16][5]
Vật liệu vơ cơ thường rất bền với mơi trường xung quanh, cĩ cấu tạo dạng xốp, nhiều lỗ nên dễ hấp phụ E, nhất là với phương pháp hấp phụ vật lý.
Các vật liệu vơ cơ thơng dụng như bột thủy tinh, silicagel, các oxyt kim loại như oxyt nhơm, oxyt magie,…Trong đĩ, cĩ một vật liệu bền, rẻ tiền và dễ kiếm được ứng dụng phổ biến trong sản xuất cơng nghiệp là diatomite, tên thương mại là celite.
Vật liệu hữu cơ dùng làm chất mang để cố định E được chia làm hai loại là polymer sinh học và polymer tổng hợp hĩa học. Chúng thường cĩ các nhĩm hoạt động hĩa học như: -NH2, -COOH, -OH, -SH,…nên dễ kết gắn với E nhưng độ bền với tác động mơi trường khơng cao, đặc biệt với các polymer sinh học rất dễ bị vi sinh vật xâm nhập và tấn cơng.
Một số chất mang là polymer sinh học sử dụng rộng rãi hiện nay là cellulose, agarose, dextran, sephadex và các dẫn xuất của chúng. Ngồi ra, chitin, chitosan cũng được xem là những vật liệu đầy hứa hẹn cho cố định E và tế bào vì rất phổ biến trong tự nhiên, rẻ tiền, là vật liệu cĩ cấu trúc siêu lỗ, dễ tạo màng, tạo hạt, tạo gen, kháng khuẩn tốt, cĩ sự hiện diện một lượng lớn các nhĩm chức tự nhiên là –NH2. Chitosan cĩ thể cố định E bằng phương pháp hấp phụ, phương pháp cộng hĩa trị, hoặc nhốt E, nhốt tế bào trong gel chitosan. Tuy nhiên, chitin và chitosan cĩ tính chất kị nước, độ trương và diện tích bề mặt tiếp xúc nhỏ nên hạn chế khả năng tiếp xúc của cơ chất với Ecđ, đặc biệt trong trường hợp cơ chất cĩ khối lượng phân tử lớn. Nếu khắc phục được nhược điểm này thì chitin và chitosan sẽ là những vật liệu lý tưởng đầy hứa hẹn cho cố định E và tế bào.
Chất mang là polymer tổng hợp hĩa học cũng khá phong phú như polyacrylamide, polyester, polyvinylalcohol, polyvinylacetate, polystyren, polyethylen ghép với vinyl monomer,…Nhĩm chất mang này cĩ ưu điểm chung là bền, cĩ tính chất cơ lý tốt, kháng khuẩn tốt, độ trương tốt, một trong số chúng cịn cĩ khả năng điều chỉnh được kích thước lỗ. Bên cạnh đĩ, chúng cịn tồn tại một số nhược điểm nhất định như là giá thành cịn cao, khả năng tương hợp sinh học kém, gây ơ nhiễm mơi trường do quá bền vững, chậm phân hủy trong tự nhiên.
1.4.3. Một số phương pháp chủ yếu tạo Ecđ [19][22][25]
E cố định được nghiên cứu và ứng dụng từ những năm 1950. Để chế tạo E cố định cĩ thể dùng các phương pháp hấp phụ, liên kết hĩa trị để gắn E. Chất dùng để gắn kết E gọi là chất mang, hiện nay người ta thường dùng 2 nhĩm chất mang là vơ cơ như Carbon hoạt tính, celite, … và hữu cơ như cellulose, tinh bột, sephadex,
agarose,…Chế phẩm E khơng tan cĩ thể ở dạng bột, hạt, phiến, màng mỏng. Trong một số trường hợp khơng cần thiết phải gắn E vào chất mang mà cĩ thể giữ nĩ ở bên trong mạng lưới polyme. Mạng lưới này khơng cho phép E thốt ra khỏi mạng nhưng vẫn đủ lớn để cơ chất và sản phẩm tạo ra qua lại dễ dàng.
1.4.3.1. Phương pháp vật lí [19][4]
Qui trình thực hiện phương pháp khá đơn giản: chất hấp phụ như cellulose, dextran, thủy tinh xốp, silicagel, … được trộn lẫn với E, ủ trong một khoảng thời gian cho phép rồi lọc, rửa phần E khơng hấp thụ. Sự hấp phụ xảy ra nhờ tương tác của các liên kết ion kị nước, hydrogen và lực Vande Waals …
Đối với một số chất mang vơ cơ như thủy tinh xốp, silicagel và silochrom cần phải trải qua giai đoạn xử lí bề mặt trước khi sử dụng nhằm loại bỏ sự hấp phụ khơng đặc hiệu và đảm bảo độ bền và độ chọn lọc cao của đoạn gắn E.
Ưu điểm của phương pháp này là hoạt tính E cố định thường cao. Tuy nhiên, nhược điểm là hoạt tính khơng ổn định lâu dài, E cĩ thể bị giải hấp phụ do sự thay đổi pH, nhiệt độ và thành phần ion.
1.4.3.2. Phương pháp hĩa học [19][24]
Cố định E bằng liên kết cộng hĩa trị với các polymer đã được hoạt hĩa là một trong những phương pháp cố định E phổ biến nhất, đảm bảo liên kết vững chắc của E với chất mang. Điều kiện cơ bản để gắn E vào chất mang khơng hịa tan hoặc gắn các phân tử E riêng biệt vào nhau bằng liên kết cộng hĩa trị là làm thế nào để các nhĩm cĩ thể hiện hoạt tính của E khơng bị tham gia vào phản ứng.
Các polymer thường dùng trong phương pháp này là cellulose, alginic acid, chitin, collagen và keratin; những chất mang polymer tổng hợp cĩ polymer của acylic acid, polyurethane, các dẫn xuất N-vinylpyrrolidon,...
1.4.3.3. Phương pháp nhốt enzyme trong khuơn gel [19]
Để bao được E trong khuơn gel, tiến hành trùng hợp hĩa các gel khi cĩ mặt enzyme. E thường được nhốt trong gel của polyacrylamide, calcium alginate,
polyvinylpirolindon, polyhydroxymethacylate, và một số gel khác. Kết quả thu được là các E bị nhốt vào trong các lỗ gel. Lỗ gel nhỏ thì E sẽ được giữ chặt ở trong lỗ gel. Cĩ thể nghiền nhỏ gel đã cĩ E bằng cách đồng hĩa hoặc ép qua rây rồi đem sấy khơ ở nhiệt độ thấp.
Hiệu quả của việc nhốt và hoạt độ riêng của Ecđ phụ thuộc vào thành phần và hoạt tính của gel. Nhược điểm của phương pháp này là Ecđcĩ thể bị giảm hoạt tính do sự phân bố khơng đều của E trong gel. Thực nghiệm cho thấy chỉ những E nằm gần bề mặt gel là tiếp xúc được với cơ chất và tham gia xúc tác phản ứng.
1.4.3.4. Phương pháp microcapsule (phương pháp tạo vi túi) [19]
Đây là một hướng cố định E bằng phương pháp vật lí được sử dụng rộng rãi hiện nay. Là quá trình tạo vi túi cĩ màng khơng thẩm thấu đối với E và chất cĩ trọng lượng phân tử cao nhưng lại cho cơ chất và sản phẩm dễ dàng thẩm thấu qua. Phương pháp này cho phép giữ E trong dung dịch gần giống với tự nhiên và sử dụng E nhiều lần vì cĩ thể tách và thu nhỏ nĩ dễ dàng khỏi sản phẩm của quá trình phản ứng bằng cách lọc.
Phương pháp tạo microcapsule rất tiện lợi để cố định các hệ polyenzyme (đa