Tinh bột là polysaccarit chủ yếu cĩ trong hạt, củ, thân cây và lá cây, phân tử lượng cao gồm các đơn vị α-glucose được nối nhau bởi các liên kết α- glycoside, cĩ cơng thức phân tử là (C6H10O5)n.
Tinh bột khơng phải một hợp chất đồng thể mà gồm hai polysaccarit khác nhau: amilose và amilopectin. Tỉ lệ amylose/amylopectin xấp xỉ ¼. Tuy nhiên, tỉ lệ này cĩ thể thay đổi phụ thuộc thời tiết, mùa vụ, tùy loại tinh bột và kĩ thuật canh tác.
Amylose: cấu tạo mạch thẳng gồm những đơn vị α – glucose (200 – 1000 gốc) liên kết nhau bằng liên kết 1,4-O-glycoside. Hàm lượng amylose cĩ ý nghĩa rất lớn đến tính chất tinh bột, cĩ liên quan mật thiết với các tính chất chức năng như độ nhớt, độ dẻo, dai, phồng nở...và vì vậy ảnh hưởng đến khả năng ứng dụng của tinh bột. Tinh bột cĩ hàm lượng amylose cao cĩ cấu trúc hồ bột cứng dễ bẻ gãy trong khi tinh bột cĩ hàm lượng amilose thấp (100% là amylopectin) cho loại hồ bột mềm hơn và dai hơn.
Amylopectin: cấu tạo cĩ mạch nhánh và mạch thẳng kết hợp nhau do các α – glucose liên kết nhau bằng liên kết 1,4-O-glycoside tạo các đoạn mạch thẳng, cịn liên kết 1,6-O-glycoside tạo các đoạn mạch nhánh.Tỷ lệ các liên kết α-D-(1-6) so với các liên kết α-D-(1-4) trong amylopectin ước tính khoảng từ 5 đến 6%.
Khi bị đun nĩng trong nước, các hạt tinh bột thủy phân, cấu trúc bị phá vỡ và giải phĩng amylose và amylopectin. Các phân tử hầu hết đều tan trong nước và cho độ nhớt cao, tạo ra một dung dịch đồng nhất hay cịn gọi là hồ tinh bột tùy theo mật độ tinh bột.
1.5.2. Đặc tính tinh bột sắn và tinh bột bắp [1][10] 1.5.2.1. Đặc tính tinh bột sắn [1][10] 1.5.2.1. Đặc tính tinh bột sắn [1][10]
Hạt tinh bột sắn (củ khoai mì) cĩ kích thước trung bình 5-35 nm, hình trịn. Thành phần hố học chính của củ sắn tươi (%): Nước: 70,25; Tinh bột: 20-34; Protein: 0,8-1,2; Chất béo: 0,3-0,40; Cellulose: 1,1-3,1; Đường: 5,13; Hàm lượng amilose: 25;…Trong củ sắn một hợp chất phaseolunatin chiếm tỉ lệ 0,001-0,04mg% gây ngộ độc khi bị thủy phân giải phĩng ra HCN.
Tỷ lệ amylose và amylopectin thơng thường trong tinh bột sắn tương ứng là 20% và 80% (tỷ lệ này cĩ thể thay đổi tùy theo điều kiện canh tác và sinh trưởng). Trong quá trình tổng hợp sinh học tinh bột, cấu trúc bán tinh thể của amylose và amylopectin được xếp chặt vào bên trong các hạt tinh bột cĩ kích thước từ 10 đến 35µm đối với củ sắn (Tongdang, 2001).
Tinh bột sắn cĩ độ trong cao hơn các tinh bột ngũ cốc do sự liên kết yếu giữa các phần tử tinh bột trong hạt.Độ nhớt của tinh bột sắn cũng đạt giá trị khá cao. Nhiệt độ hồ hĩa trung bình 67-75oC. Hồ bột sắn thường dai là do hàm lượng amylose tương đối thấp (20-25%) và do cấu trúc của amylopectin.
1.5.2.2. Đặc tính tinh bột bắp [14][31]
Bắp là cây trồng chiếm 36% sản lượng trên thế giới. Bên cạnh vai trị lương thực, nguồn tài nguyên tự nhiên, tái sinh được, đa dụng và cĩ tính tự hoại này đang cĩ nhiều ứng dụng khác trong thương mại. Tinh bột, thành phần chính cĩ trong bắp, là một polysaccharide hình thành từ nhiều nhĩm đường đơn α-glucose với liên kết carbon 1-4 tạo thành mạch dài chứa 500-2000 đơn vị đường đơn glucose.
Hạt tinh bột bắp (bắp vàng) cĩ kích thước trung bình 5-20μm, hình đa giác, trịn. Cĩ thành phần (%) hĩa học chính như sau: amylose: 20; protein: 6-10; độ ẩm trung bình khoảng 9,5; chất tro: 1,6; chất béo: 5,1; cellulose: 4.1; …Nhiệt độ hồ hĩa khoảng 52-59oC.
1.5.3. Các phương pháp thủy phân tinh bột [1][10]
Một tính chất quan trọng của tinh bột là quá trình thủy phân liên kết α-D (1,4); (1,6)…- glycoside giữa các đơn vị glucose bằng acid hoặc bằng enzyme. Đặc trưng của phản ứng này là sự giảm nhanh độ nhớt và sinh ra đường.
1.5.3.1. Thủy phân tinh bột bằng acid [10][32]
Dưới tác dụng của axit một phần các liên kết giữa các phân tử và trong phân tử tinh bột bị đứt, làm giảm kích thước phân tử, tinh bột thu được những tính chất mới.
Acid được sử dụng trong cơng nghiệp để sản xuất dextrin, maltodextrin và một vài loại siro cĩ đương lượng dextro (dextrose equivalent - DE) khoảng 40. Sản phẩm cĩ DE thấp thường bị thối hĩa do thủy phân khơng hồn tồn, cịn sản phẩm DE cao hơn lại cĩ độ ổn định màu và vị kém.
Sự thủy phân tinh bột bằng acid đã được sử dụng rộng rãi trong quá khứ. Nhưng hiện nay gần như được thay thế bằng các quá trình thủy phân bằng E. Vì sử dụng acid địi hỏi các vật liệu chống ăn mịn, tăng độ màu và hàm lượng muối trong sản phẩm, cần nhiều năng lượng để nâng nhiệt độ phản ứng và tương đối khĩ kiểm sốt. Ngồi ra, các acid mạnh dùng trong thủy phân khơng thân thiện với mơi trường và gây nhiều khĩ khăn cho xử lí nước thải.
1.5.3.2. Thủy phân tinh bột bằng enzyme [11][33]
Tinh bột cĩ thể bị thủy phân bởi hệ E đặc hiệu với liên kết α-1,4 như hệ enzyme amylase; hay bởi các enzyme đặc hiệu với liên kết α-1,6 như pululanase,…; hay bởi các enzyme đặc hiệu với liên kết α-1,6 và liên kết α-1,4 như γ-amylase,…
Trong sản xuất cơng nghiệp các đặc điểm và các tính chất của các sản phẩm thường phụ thuộc vào nguồn E được sử dụng, nồng độ E và thời gian thủy phân.
Quá trình thủy phân tinh bột từ E vi sinh vật tạo dung dịch đường cĩ thể chia làm 3 giai đoạn theo sơ đồ:
1.5.4. Các sản phẩm thủy phân tinh bột và ứng dụng [14]
Hiện nay, nấm mốc được dùng phổ biến để thu chế phẩm amylase đường hĩa các nguồn nguyên liệu tinh bột trong sản xuất rượu, bia, sinh khối nấm men, …
Trong cơng nghệ sản xuất sinh khối nấm men, sản phẩm thu được là những tế bào chứa hàm lượng protein rất cao (40-60%), đồng thời cịn chứa lượng khơng nhỏ các chất béo, vitamin và các chất khống. Đặc biệt, protein vi sinh vật theo hàm lượng axit amin, vitamin và mức độ hấp thụ cịn vượt trội hơn nguồn protein động vật. Vì vậy, việc dùng sinh khối nấm men khơ làm nguồn protein-vitamin bổ sung trong khẩu phần thức ăn chăn nuơi gia súc và gia cầm đã mang lại hiệu quả kinh tế to lớn. Sản phẩm này thường được gọi là Men gia súc hay Men thức ăn chăn nuơi, hay nguồn protein đơn bào (SCP)cĩ ý nghĩa rất quan trọng đối với ngành kinh tế quốc dân.
Quy trình cơng nghệ sản xuất sinh khối nấm men từ sản phẩm đường hĩa nguồn nguyên liệu tinh bột nhờ Asp. nigerđược tĩm tắt theo sơ đồ sau:
Hình 1.4: Sơ đồ quá trình thủy phân tinh bột bởi E vi sinh vật [14]
Tinh bột
Dextrin hĩa α - amylase
Glucoamylase β - amylase
Pululanase Oligosaccharid, maltose, α - glucose
Đường hĩa
Dextrin mạch thẳng và mạch nhánh
Glucoisomerase Fructose Đồng phân hĩa
Hình 1.5: Sơ đồ quy trình cơng nghệ sản xuất sinh khối nấm men[14] Asp. niger Tinh bột α - glucose γ - amylase Nhân giống Nấm men
D-glucose, các muối vơ cơ
Li tâm Nuơi thu sinh khối Mơi trường dinh dưỡng
Xử lý Sinh khối
Thải bỏ
Sấy khơ Thành phẩm
Phần 2
Vật liệu –
PHẦN 2: NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên vật liệu 2.1.1. Nguyên liệu 2.1.1. Nguyên liệu
- Vi sinh vật: Nấm mốc Asp. niger từ Bộ mơn Sinh hĩa trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Tp. HCM. Nấm men Saccharomyces cerevisiae thương phẩm (Hãng Angel, Trung Quốc).
- Enzyme: γ-amylase hịa tan thương phẩm (Hãng Novo Đan mạch).
- Cơ chất: Bột năng (mua tại các chợ trong thành phố) và tinh bột tan (phịng thí nghiệm sinh hĩa trường Đại học KHTN cung cấp).
- Chất mang vơ cơ diatomite (celite) và hữu cơ chitosan (phịng thí nghiệm sinh hĩa trường Đại học KHTN cung cấp).
2.1.2. Hĩa chất và dụng cụ thí nghiệm
Các loại hĩa chất và dụng cụ thí nghiệm do phịng thí nghiệm Vi sinh – Sinh hĩa Trường Đại học Sư phạm, Tp. HCM và phịng thí nghiệm Sinh hĩa Trường Đại học Khoa học Tự nhiên cung cấp.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp giữ giống Asp. niger [20]
* Nguyên tắc
Nấm mốc Asp. niger cĩ khả năng sinh bào tử nên cĩ thể giữ giống bằng cách cấy trên mơi trường thạch nghiêng PGA (Potato glucose agar).
* Mơi trường PGA gồm: Khoai tây: 100g; Glucose: 10g; Agar: 10g; Nước cất: 500ml; pH = 6.5; Hấp khử trùng 1210
C, 15 phút.
* Cách tiến hành:
- Khoai tây gọt vỏ, rửa sạch, cắt lát mỏng và nấu chín.
- Cho agar vào dịch đang đun, khuấy liên tục cho đến khi agar tan hồn tồn, tiếp tục cho glucose vào, khuấy đều cho tan rồi đổ vào các ống nghiệm, đậy nút bơng, hấp khử trùng. Sau đĩ, đặt nghiêng các ống nghiệm tạo thạch nghiêng.
- Cấy chuyền từ ống giống sang các ống thạch nghiêng, nuơi ở t0 = 30-350C trong 2-3 ngày cho bào tử mọc đều bề mặt thạch nghiêng, bảo quản ở t0
= 5-90C.
2.2.2. Quan sát các đặc điểm hình thái của chủng giống Asp. niger [12][20]
2.2.2.1. Quan sát đại thể[12][20]
Sau khi hoạt hĩa giống ta tiến hành tạo khuẩn lạc khổng lồ theo các bước sau: - Chuẩn bị mơi trường Czapek Dox cải tiến (gồm : 1,5g KH2PO4; 3,5g NaNO3; 20g glucose; 0,5g KCl; 0,5g MgSO4.7H2O; 0,1g FeSO4.7H2O; 20g agar; 1000ml nước cất; khử trùng 1210
C, 1atm, 15 phút) đổ vào 2-3 đĩa petri dày khoảng 3mm.
- Dùng que cấy lấy bào tử từ ống giống thạch nghiêng rồi cấy chấm điểm vào mặt thạch ở giữa hộp petri.
- Nuơi cấy ở nhiệt độ 300C trong khoảng 7 ngày.
- Dùng kính lúp ba chiều soi mơ tả các đặc điểm: hình thái, kích thước, màu sắc khuẩn lạc, dạng sợi nấm mọc ở trên mặt thạch, đặc điểm mép khuẩn lạc, …
2.2.2.2. Quan sát vi thể bằng kĩ thuật làm phịng ẩm[20]
- Chuẩn bị mơi trường Czapek Dox cải tiến đổ vào 2-3 đĩa petri dày khoảng 1mm. Khi thạch đã đơng, dùng khoan nút chai vơ trùng cĩ d ≈9mm khoan các khối thạch.
- Chuẩn bị các đĩa petri sạch, lame, lamelle, giấy thấm vơ trùng.
- Đặt khối thạch lên lame. Cấy một ít bào tử nấm mốc lên bề mặt xung quanh khối thạch. Đậy lamelle lại và cho vào hộp petri cĩ sẵn giấy thấm được làm ẩm bằng nước cất vơ trùng.
- Sau 2-3 ngày nuơi ở nhiệt độ phịng 30 – 320C, gỡ lamelle ra, úp lên một lame sạch khác. Gỡ bỏ khối thạch và để nguyên phần nấm sợi trên phiến kính, nhỏ giọt lactophenol, đậy lamelle lên trên ta được tiêu bản để quan sát các đặc điểm hình
thái nấm sợi ở vật kính x40: giá bào tử thể, thể bình, cuống thể bình, sợi nấm cĩ hay khơng cĩ sự phân nhánh và vách ngăn, đặc điểm bào tử,…
2.2.3. Phương pháp định lượng mật độ tế bào trực tiếp bằng buồng đếm hồng cầu [9][12][20] cầu [9][12][20]
* Cấu trúc buồng đếm
Buồng đếm Goriaep là một phiến kính dày hình chữ nhật, ở phần giữa là lõm phẳng, tại đây cĩ kẻ một lưới gồm 4,5 hình vuơng cĩ diện tích tổng cộng là 1mm2 và được chia thành 25 ơ vuơng lớn (1/25 mm2 / 1 ơ). Mỗi ơ nhỏ cĩ diện tích là 1/400 mm2, mỗi ơ lớn cĩ thể tích là 4.10-6 ml.
* Cách tiến hành
Lắc mạnh dịch huyền phù, dùng pipetman nhỏ một giọt dịch huyền phù lên bề mặt khung đếm. Đặt khung đếm lên bàn kính hiển vi. Đếm ít nhất 5 ơ lớn, lấy trị số trung bình (khơng quá 10 tế bào/1 ơ nhỏ ≈ 2.5 < a <10).
* Cách tính kết quả:
Số tế bào trên 1ml mẫu phân tích (N): N (tế bào/ml) =
Trong đĩ: a: số tế bào trung bình cĩ trong một ơ lớn. v: thể tích một ơ lớn = 4 x 104.
K: hệ số pha lỗng mẫu.
Vậy N (tế bào/ml) = = 0.25 x a x K x 106.
* Định lượng tế bào bằng phương pháp đo mật độ quang
a/ Nguyên tắc
Tế bào VSV là 1 thực thể nên khi hiện diện trong mơi trường lỏng làm cản ánh sáng, làm phân tán chùm ánh sáng tới và làm đục mơi trường. Độ đục của huyền phù tỉ lệ với mật độ tế bào. Do vậy cĩ thể định lượng mật độ tế bào 1 cách gián tiếp thơng qua đo độ đục bằng máy so màu ở bước sĩng 610nm.
b/ Cách tiến hành
Xây dựng đường tương quan tuyến tính giữa độ đục và mật độ tế bào bằng cách:
- Pha lỗng 1 huyền phù chứa bào tử nấm mốc cần kiểm nghiệm cĩ mật độ bất kì thành các huyền phù khác nhau cĩ độ đục đo ở OD610nm đạt các giá trị lân cận 0.1; 0.2; 0.3; 0.4; 0.5. Đo OD610nm của các huyền phù vừa được pha, ghi nhận số đo thực tế.
- Dùng phương pháp đếm trực tiếp dưới kính hiển vi (dùng khung đếm hồng cầu), xác định mật độ tế bào (N/ml) của các huyền phù này.
- Tính giá trị log (N/ml) cho mỗi giá trị mật độ N/ml tương ứng với mỗi độ đục. Vẽ đường biểu diễn của log (N/ml) theo OD610nm.
* Xác định mật độ tế bào theo độ đục
- Đo độ đục của 1 huyền phù tế bào cần xác định mật độ.
- Từ trị số OD610nm đo được, suy ra trị số log(N/ml) và trị số mật độ N/ml (N/ml = 10avới a= log(N/ml)) từ đường chuẩn.
2.2.4. Phương pháp khảo sát thời gian nuơi cấy và thành phần mơi trường nuơi
cấy Asp. niger thu γ – amylase [8]
* Mơi trường nuơi cấy: Cám: 70% - 75%; Trấu: 25%; Bột năng (hay bột bắp): 1 - 5%.
* Dung dịch khống bổ sung vào mơi trường tạo độ ẩm 50% gồm: NaNO3: 3g; K2HPO4: 1g; MgSO4: 0.5g; KCl: 0.5g; FeSO4: 0.1g; Nước cất: 1000ml; Khử trùng 1210C, 1atm, 15 phút.
* Cách tiến hành
- Hỗn hợp cám, trấu, bột năng (hay bột bắp) sau khi bổ sung dung dịch khống được trộn đều rồi chia đều vào các erlen, bịt bơng gịn.
- Dùng pipet hút 1 ml dung dịch huyền phù nấm mốc cấy vào mỗi erlen (30g mơi trường/1 erlen) (lượng bào tử cho vào khoảng 15x107
).
- Nuơi cấy ở nhiệt độ phịng, thỉnh thoảng dùng tay lắc đều mơi trường để giữ độ xốp và thống khí.
2.2.5. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng sinh tổng hợp γ – amylase từ Asp. niger
[3][7][9]
2.2.5.1. Thời gian nuơi cấy
- Tại mỗi thời điểm nuơi cấy (2; 2,5; 3; 3,5; 4 ngày), lấy 10g mơi trường nuơi cấy nấm mốc hịa trong 20 ml nước cất, để trên máy lắc 30 phút, nghiền rồi lọc qua vải, sau đĩ li tâm 5000 vịng/phút trong 10 phút.
-Thu lấy dịch ly tâm, lọc qua giấy lọc, thu dịch E thơ.
- Pha lỗng dịch E thơ lần lượt 10 lần, 50 lần, 100 lần tùy vào thời điểm cần khảo sát hoạt độ.
- Tiến hành phản ứng xác định hoạt độ E theo từng thời điểm nuơi cấy theo mục 2.2.7.
- Vẽ đồ thị biểu diễn sự biến đổi của hoạt độ γ – amylase theo thời gian nuơi cấy khác nhau của chủng nấm mốc Asp. niger.
2.2.5.2. Thành phần mơi trường thay đổi
- Lần lượt thay đổi tỷ lệ cám gạo và bột năng (hay bột bắp) trong thành phần mơi trường nuơi cấy theo các tỉ lệ: 75/1; 74/2; 73/3; 72/4; 71/5 (gram).
- Tiến hành nuơi cấy và xác định hoạt độ γ – amylase theo sự thay đổi thành phần mơi trường của nấm mốc Asp. nigertheo mục 2.2.4, 2.2.6 và 2.2.7.
2.2.6. Phương pháp thu nhận γ – amylase từ Asp. niger[9][14][25]
- Nuơi cấy nấm mốc trong khoảng thời gian và mơi trường tối ưu.
- Tách chiết, thu nhận chế phẩm E bán tinh khiết được thực hiện bằng cách sau: Mơi trường nuơi nấm mốc được khuấy trộn với nước cất (tỷ lệ nước cất và mơi trường là 2:1), lọc qua vải lọc lấy dịch lọc, thu được phần dịch chứa E. Làm lạnh nhanh dịch chiết E xuống cịn 3-50
C, kết tủa E bằng cồn theo tỷ lệ 4 cồn : 1 dịch enzyme (cồn cũng đã được làm lạnh 3-50C). Ly tâm dịch tủa trong 15 phút ở tốc độ
6000 vịng/phút. Thu tủa, sấy ở nhiệt độ 35-400C cho đến khi độ ẩm của tủa đạt 11- 14%. Thu được chế phẩm E khơ. Bảo quản ở nhiệt độ lạnh.
2.2.7. Xác định hoạt độ γ – amylase theo phương pháp so màu với DNS [9] 2.2.7.1. Nguyên tắc