2.1.1. Nguyên liệu
- Vi sinh vật: Nấm mốc Asp. niger từ Bộ mơn Sinh hĩa trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Tp. HCM. Nấm men Saccharomyces cerevisiae thương phẩm (Hãng Angel, Trung Quốc).
- Enzyme: γ-amylase hịa tan thương phẩm (Hãng Novo Đan mạch).
- Cơ chất: Bột năng (mua tại các chợ trong thành phố) và tinh bột tan (phịng thí nghiệm sinh hĩa trường Đại học KHTN cung cấp).
- Chất mang vơ cơ diatomite (celite) và hữu cơ chitosan (phịng thí nghiệm sinh hĩa trường Đại học KHTN cung cấp).
2.1.2. Hĩa chất và dụng cụ thí nghiệm
Các loại hĩa chất và dụng cụ thí nghiệm do phịng thí nghiệm Vi sinh – Sinh hĩa Trường Đại học Sư phạm, Tp. HCM và phịng thí nghiệm Sinh hĩa Trường Đại học Khoa học Tự nhiên cung cấp.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp giữ giống Asp. niger [20]
* Nguyên tắc
Nấm mốc Asp. niger cĩ khả năng sinh bào tử nên cĩ thể giữ giống bằng cách cấy trên mơi trường thạch nghiêng PGA (Potato glucose agar).
* Mơi trường PGA gồm: Khoai tây: 100g; Glucose: 10g; Agar: 10g; Nước cất: 500ml; pH = 6.5; Hấp khử trùng 1210
C, 15 phút.
* Cách tiến hành:
- Khoai tây gọt vỏ, rửa sạch, cắt lát mỏng và nấu chín.
- Cho agar vào dịch đang đun, khuấy liên tục cho đến khi agar tan hồn tồn, tiếp tục cho glucose vào, khuấy đều cho tan rồi đổ vào các ống nghiệm, đậy nút bơng, hấp khử trùng. Sau đĩ, đặt nghiêng các ống nghiệm tạo thạch nghiêng.
- Cấy chuyền từ ống giống sang các ống thạch nghiêng, nuơi ở t0 = 30-350C trong 2-3 ngày cho bào tử mọc đều bề mặt thạch nghiêng, bảo quản ở t0
= 5-90C.
2.2.2. Quan sát các đặc điểm hình thái của chủng giống Asp. niger [12][20]
2.2.2.1. Quan sát đại thể[12][20]
Sau khi hoạt hĩa giống ta tiến hành tạo khuẩn lạc khổng lồ theo các bước sau: - Chuẩn bị mơi trường Czapek Dox cải tiến (gồm : 1,5g KH2PO4; 3,5g NaNO3; 20g glucose; 0,5g KCl; 0,5g MgSO4.7H2O; 0,1g FeSO4.7H2O; 20g agar; 1000ml nước cất; khử trùng 1210
C, 1atm, 15 phút) đổ vào 2-3 đĩa petri dày khoảng 3mm.
- Dùng que cấy lấy bào tử từ ống giống thạch nghiêng rồi cấy chấm điểm vào mặt thạch ở giữa hộp petri.
- Nuơi cấy ở nhiệt độ 300C trong khoảng 7 ngày.
- Dùng kính lúp ba chiều soi mơ tả các đặc điểm: hình thái, kích thước, màu sắc khuẩn lạc, dạng sợi nấm mọc ở trên mặt thạch, đặc điểm mép khuẩn lạc, …
2.2.2.2. Quan sát vi thể bằng kĩ thuật làm phịng ẩm[20]
- Chuẩn bị mơi trường Czapek Dox cải tiến đổ vào 2-3 đĩa petri dày khoảng 1mm. Khi thạch đã đơng, dùng khoan nút chai vơ trùng cĩ d ≈9mm khoan các khối thạch.
- Chuẩn bị các đĩa petri sạch, lame, lamelle, giấy thấm vơ trùng.
- Đặt khối thạch lên lame. Cấy một ít bào tử nấm mốc lên bề mặt xung quanh khối thạch. Đậy lamelle lại và cho vào hộp petri cĩ sẵn giấy thấm được làm ẩm bằng nước cất vơ trùng.
- Sau 2-3 ngày nuơi ở nhiệt độ phịng 30 – 320C, gỡ lamelle ra, úp lên một lame sạch khác. Gỡ bỏ khối thạch và để nguyên phần nấm sợi trên phiến kính, nhỏ giọt lactophenol, đậy lamelle lên trên ta được tiêu bản để quan sát các đặc điểm hình
thái nấm sợi ở vật kính x40: giá bào tử thể, thể bình, cuống thể bình, sợi nấm cĩ hay khơng cĩ sự phân nhánh và vách ngăn, đặc điểm bào tử,… (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
2.2.3. Phương pháp định lượng mật độ tế bào trực tiếp bằng buồng đếm hồng cầu [9][12][20] cầu [9][12][20]
* Cấu trúc buồng đếm
Buồng đếm Goriaep là một phiến kính dày hình chữ nhật, ở phần giữa là lõm phẳng, tại đây cĩ kẻ một lưới gồm 4,5 hình vuơng cĩ diện tích tổng cộng là 1mm2 và được chia thành 25 ơ vuơng lớn (1/25 mm2 / 1 ơ). Mỗi ơ nhỏ cĩ diện tích là 1/400 mm2, mỗi ơ lớn cĩ thể tích là 4.10-6 ml.
* Cách tiến hành
Lắc mạnh dịch huyền phù, dùng pipetman nhỏ một giọt dịch huyền phù lên bề mặt khung đếm. Đặt khung đếm lên bàn kính hiển vi. Đếm ít nhất 5 ơ lớn, lấy trị số trung bình (khơng quá 10 tế bào/1 ơ nhỏ ≈ 2.5 < a <10).
* Cách tính kết quả:
Số tế bào trên 1ml mẫu phân tích (N): N (tế bào/ml) =
Trong đĩ: a: số tế bào trung bình cĩ trong một ơ lớn. v: thể tích một ơ lớn = 4 x 104.
K: hệ số pha lỗng mẫu.
Vậy N (tế bào/ml) = = 0.25 x a x K x 106.
* Định lượng tế bào bằng phương pháp đo mật độ quang
a/ Nguyên tắc
Tế bào VSV là 1 thực thể nên khi hiện diện trong mơi trường lỏng làm cản ánh sáng, làm phân tán chùm ánh sáng tới và làm đục mơi trường. Độ đục của huyền phù tỉ lệ với mật độ tế bào. Do vậy cĩ thể định lượng mật độ tế bào 1 cách gián tiếp thơng qua đo độ đục bằng máy so màu ở bước sĩng 610nm.
b/ Cách tiến hành
Xây dựng đường tương quan tuyến tính giữa độ đục và mật độ tế bào bằng cách:
- Pha lỗng 1 huyền phù chứa bào tử nấm mốc cần kiểm nghiệm cĩ mật độ bất kì thành các huyền phù khác nhau cĩ độ đục đo ở OD610nm đạt các giá trị lân cận 0.1; 0.2; 0.3; 0.4; 0.5. Đo OD610nm của các huyền phù vừa được pha, ghi nhận số đo thực tế.
- Dùng phương pháp đếm trực tiếp dưới kính hiển vi (dùng khung đếm hồng cầu), xác định mật độ tế bào (N/ml) của các huyền phù này.
- Tính giá trị log (N/ml) cho mỗi giá trị mật độ N/ml tương ứng với mỗi độ đục. Vẽ đường biểu diễn của log (N/ml) theo OD610nm.
* Xác định mật độ tế bào theo độ đục
- Đo độ đục của 1 huyền phù tế bào cần xác định mật độ.
- Từ trị số OD610nm đo được, suy ra trị số log(N/ml) và trị số mật độ N/ml (N/ml = 10avới a= log(N/ml)) từ đường chuẩn.
2.2.4. Phương pháp khảo sát thời gian nuơi cấy và thành phần mơi trường nuơi
cấy Asp. niger thu γ – amylase [8]
* Mơi trường nuơi cấy: Cám: 70% - 75%; Trấu: 25%; Bột năng (hay bột bắp): 1 - 5%.
* Dung dịch khống bổ sung vào mơi trường tạo độ ẩm 50% gồm: NaNO3: 3g; K2HPO4: 1g; MgSO4: 0.5g; KCl: 0.5g; FeSO4: 0.1g; Nước cất: 1000ml; Khử trùng 1210C, 1atm, 15 phút.
* Cách tiến hành
- Hỗn hợp cám, trấu, bột năng (hay bột bắp) sau khi bổ sung dung dịch khống được trộn đều rồi chia đều vào các erlen, bịt bơng gịn.
- Dùng pipet hút 1 ml dung dịch huyền phù nấm mốc cấy vào mỗi erlen (30g mơi trường/1 erlen) (lượng bào tử cho vào khoảng 15x107
).
- Nuơi cấy ở nhiệt độ phịng, thỉnh thoảng dùng tay lắc đều mơi trường để giữ độ xốp và thống khí. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
2.2.5. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng sinh tổng hợp γ – amylase từ Asp. niger
[3][7][9]
2.2.5.1. Thời gian nuơi cấy
- Tại mỗi thời điểm nuơi cấy (2; 2,5; 3; 3,5; 4 ngày), lấy 10g mơi trường nuơi cấy nấm mốc hịa trong 20 ml nước cất, để trên máy lắc 30 phút, nghiền rồi lọc qua vải, sau đĩ li tâm 5000 vịng/phút trong 10 phút.
-Thu lấy dịch ly tâm, lọc qua giấy lọc, thu dịch E thơ.
- Pha lỗng dịch E thơ lần lượt 10 lần, 50 lần, 100 lần tùy vào thời điểm cần khảo sát hoạt độ.
- Tiến hành phản ứng xác định hoạt độ E theo từng thời điểm nuơi cấy theo mục 2.2.7.
- Vẽ đồ thị biểu diễn sự biến đổi của hoạt độ γ – amylase theo thời gian nuơi cấy khác nhau của chủng nấm mốc Asp. niger.
2.2.5.2. Thành phần mơi trường thay đổi
- Lần lượt thay đổi tỷ lệ cám gạo và bột năng (hay bột bắp) trong thành phần mơi trường nuơi cấy theo các tỉ lệ: 75/1; 74/2; 73/3; 72/4; 71/5 (gram).
- Tiến hành nuơi cấy và xác định hoạt độ γ – amylase theo sự thay đổi thành phần mơi trường của nấm mốc Asp. nigertheo mục 2.2.4, 2.2.6 và 2.2.7.
2.2.6. Phương pháp thu nhận γ – amylase từ Asp. niger[9][14][25]
- Nuơi cấy nấm mốc trong khoảng thời gian và mơi trường tối ưu.
- Tách chiết, thu nhận chế phẩm E bán tinh khiết được thực hiện bằng cách sau: Mơi trường nuơi nấm mốc được khuấy trộn với nước cất (tỷ lệ nước cất và mơi trường là 2:1), lọc qua vải lọc lấy dịch lọc, thu được phần dịch chứa E. Làm lạnh nhanh dịch chiết E xuống cịn 3-50
C, kết tủa E bằng cồn theo tỷ lệ 4 cồn : 1 dịch enzyme (cồn cũng đã được làm lạnh 3-50C). Ly tâm dịch tủa trong 15 phút ở tốc độ
6000 vịng/phút. Thu tủa, sấy ở nhiệt độ 35-400C cho đến khi độ ẩm của tủa đạt 11- 14%. Thu được chế phẩm E khơ. Bảo quản ở nhiệt độ lạnh.
2.2.7. Xác định hoạt độ γ – amylase theo phương pháp so màu với DNS [9] 2.2.7.1. Nguyên tắc 2.2.7.1. Nguyên tắc
Hoạt độ γ – amylase (gluco-amylase) được tính dựa trên lượng glucose tạo ra khi thủy phân tinh bột bằng enzyme. Hàm lượng glucose được xác định bằng cách đo mật độ quang của dung dịch tạo màu khi cĩ mặt thuốc thử DNS (3, 5 dinitro salicilic acid) tại bước sĩng 530nm.
Một đơn vị hoạt tính γ – amylase xúc tác thủy phân tinh bột, giải phĩng 1 μg glucose trong 1 phút, ở điều kiện nhiệt độ 450C, pH 5.
2.2.7.2. Cách tính
HđC =
Với: m: Hàm lượng glucose (μg/ml). L: Độ pha lỗng mẫu.
5: Thể tích dung dịch phản ứng (ml). t: thời gian phản ứng (10 phút).
HđC: hoạt độ chung γ – amylase (UI/g_CPE).
2.2.8. Định lượng protein hịa tan trong CPE theo phương pháp Lowry [12][26]
Phương pháp này dùng để xác định lượng protein hịa tan cĩ trong 1 gram chế phẩm enzyme (hay 1ml chế phẩm enzyme lỏng), từ đĩ xác định hoạt tính riêng của enzyme trên 1mg protein enzyme. Phương pháp này cũng được sử dụng để định lượng protein trong các nguyên liệu khác.
2.2.8.1. Nguyên tắc
Hầu hết các protein đều chứa Tyrosin và Tryptophan. Hàm lượng của những acid amin này tùy thuộc vào loại protein, vì vậy những protein cùng loại với nhau sẽ chứa hàm lượng acid amin này như nhau.
m. L. 5 t
Khi cho protein tác dụng với thuốc thử Folin sẽ tạo một phức chất cĩ màu, cường độ màu tỷ lệ với hàm lượng Tyrosin và Tryptophan, vì thế cĩ thể dùng phương pháp so màu để xác định hàm lượng protein. Phương pháp này cĩ độ nhạy cao, cho phép phát hiện được protein trong dung dịch ở nồng độ 1μg/ml. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
2.2.8.2. Hĩa chất
Dung dịch albumin 0.1%: 0.1g albumin pha nước cất thành 100ml dung dịch. Dung dịch A: 2g Na2CO3 hịa tan trong NaOH N/10 thành 100ml dung dịch. Dung dịch B: cân 0.5g CuSO4 hịa tan trong dung dịch citrat natri 1% thành 100ml dung dịch.
Dung dịch C: chỉ pha để dùng ngay trong ngày gồm hỗn hợp của 2 dung dịch A và B theo tỷ lệ 49/1.
2.2.8.3. Cách tiến hành
Hút 0.4ml dung dịch cĩ chứa protein cho vào ống nghiệm sạch khơ, thêm 2ml dung dịch C, lắc đều và để yên ở nhiệt độ thường trong 10 phút. Sau đĩ thêm 0.2ml thuốc thử Folin vào, lắc đều trong 5-10 phút, thêm nước cất cho đủ 5ml, đem đo mật độ quang ở bước sĩng 520nm.
2.2.8.4. Cách tính * Dựng đường chuẩn * Dựng đường chuẩn
Thực hiện xây dựng đường chuẩn với một loại protein tinh khiết cĩ sẵn, thơng thường dùng albumin tinh khiết. Hút 0.4ml dung dịch albumin chuẩn cĩ nồng độ theo thứ tự: 0; 50; 100; 150; 200; 250 μg/ml vào các ống nghiệm sạch khơ đã đánh số phân biệt. Thực hiện phản ứng tương tự như trên. Muốn vậy phải thực hiện theo bảng sau để cĩ được các dung dịch albumin chuẩn với nồng độ khác nhau:
Ống nghiệm số 0 1 2 3 4 5
Nồng độ protein (μg/ml) 0 50 100 150 200 250
Dung dịch albumin 0.1% (ml) 0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5
Vẽ đồ thị biểu diễn sự biến thiên của mật độ quang ở bước sĩng 750nm (∆OD) theo nồng độ protein chuẩn (μg/ml).
* Tính kết quả
Từ đồ thị chuẩn, trên cơ sở giá trị mật độ quang (trục tung) đo được của mẫu thí nghiệm cĩ chứa protein cần xác định, ta suy ra hàm lượng protein của mẫu cần đo.
2.2.9. Xác định hoạt độ riêng của các chế phẩm enzyme [9]
Hoạt độ của chế phẩm enzyme được xác định theo cơng thức:
CPE CPE UI HđC / g HđR mg _ protein _ E / g mg _ protein _ E = = ∑
Với: + HđR: hoạt độ riêng. + HđC: hoạt độ chung.
+ ∑ĐVHđ: Số đơn vị hoạt độ enzyme/g CPE hay /ml CPE (∑UI/g hay ∑UI/ml).
+ C: mg protein/ml dung dịch enzyme hay /g CPE. + CPE: chế phẩm enzyme
+ UI: đơn vị hoạt độ enzyme.
+ ∑ UI: tổng đơn vị hoạt độ enzyme.
2.2.10. Lựa chọn phương pháp cố định γ-amylase [9][19]
2.2.10.1. Cố định γ-amylase lên màng chitosan bằng phương pháp cộng hĩa trị * Nguyên tắc * Nguyên tắc
Dựa vào liên kết cộng hĩa trị được hình thành giữa γ-amylase lên màng chitosan.
* Cách tiến hành
Dung dịch chitosan được chuẩn bị bằng cách hịa tan 1g chitosan trong 100ml acid acetic 1%. Sau đĩ đổ dung dịch chitosan 1% lên phiến kính phẳng và để khơ trong trong khơng khí trong tủ hút. Màng chitosan được ngâm trong dung dịch NaOH 0.1M/24h để trung hịa lượng acid dư. Sau đĩ màng được rửa nhiều lần với nước cất cho đến khi nước rửa trung tính và để khơ ở nhiệt độ phịng. Màng chitosan chuẩn cĩ bề dày khoảng 50μm.
1g chitosan tạo được 250m2
màng.
* Hoạt hĩa màng chitosan
Màng chitosan được ngâm và lắc trong dung dịch glutaraldehyde 2%/4h ở nhiệt độ phịng, rửa mẫu nhiều lần với nước cất nhằm loại hết dư lượng glutaraldehyde. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
* Cố địnhγ-amylase lên màng chitosan bằng phương pháp cộng hĩa trị
Màng chitosan đã được hoạt hĩa bằng glutaraldehyde được ngâm và lắc với 50ml dung dịch đệm chứa 0.2g chế phẩm γ-amylase/1-5h ở nhiệt độ phịng. Tiếp tục dùng dung dịch đệm (với thể tích xác định) rửa màng chitosan đã cĩ enzyme cố định để loại bỏ các enzyme khơng gắn kết lên màng. Lượng protein cố định và hoạt tính γ-amylase được xác định gián tiếp qua lượng protein và tổng đơn vị hoạt độ E hiện diện trong nước rửa.
2.2.10.2. Cố định γ-amylase lên chất mang là Celite (Diatomite) bằng phương pháp hấp phụ [14] pháp hấp phụ [14]
* Nguyên tắc
Dựa vào khả năng hấp phụ γ-amylase lên chất mang Celite.
* Cách tiến hành
- Cân 0.2g enzyme pha thành 50ml với dung dịch hệ đệm pH 5.
- Cân 5g diatomite, cho từ từ vào 50ml dung dịch enzyme trên, khuấy hỗn hợp trong 30 phút ở 40C, lọc dịch lọc bằng giấy lọc.
- D ịch sau khi l
enzyme
* Cách tính hiệu suất gắn protein:
HScố định protein (%) =
(Hàm lượng Pr cố định = HLPr trước khi cố định – HLPr cịn trong dịch lọc)
Với: + HS: hiệu suất. + HL: hàm lượng.
+ Pr : protein.
* Cách tính hiệu suất hoạt độ enzyme γ-amylase cố định:
HS hoạt độ E cố định (%) = x100%
2.2.11. Phương pháp sử dụng γ-amylasecđ từ Asp. niger và thương mại để thủy
phân các loại tinh bột [12][15] * Nguyên tắc
Chế phẩm γ-amylase cố định trên chất mang phù hợp ở trên sẽ được dùng thủy phân tinh bột sắn và tinh bột bắp ở nhiệt độ 450
C và pH=5 với độ biến thiên thời gian là 30 phút. Khả năng thủy phân dựa vào lượng đường khử tạo thành.
* Cách tiến hành
Cho 20ml dung dịch cơ chất 2% vào erlen 100ml, thêm vào 20ml dung dịch đệm pH 5, rồi bổ sung lượng enzyme cố định, để trên bồn ổn nhiệt và giữ ổn định ở nhiệt độ 450C để thực hiện phản ứng thủy phân của γ-amylase trên cơ chất. Cứ mỗi 30 phút lấy ra 1ml đem xác định lượng đường khử tạo thành, từ đĩ xác định được thời gian phù hợp để cĩ lượng đường tối đa.
2.2.12. Phương pháp khảo sát khả năng tái sử dụng của CPEγ-amylasecđ * Nguyên tắc * Nguyên tắc
HL Pr cốđịnh
HL Pr trướckhi cốđịnh x 100
Quá trình thủy phân tinh bột bởi Ecđ được lặp lại nhiều lần trong bình chiết để hạn chế sự hao tổn Ecđ. Kết quả mỗi lần lặp lại được xác định qua lượng đường