2.2.7.1. Nguyên tắc
Hoạt độ γ – amylase (gluco-amylase) được tính dựa trên lượng glucose tạo ra khi thủy phân tinh bột bằng enzyme. Hàm lượng glucose được xác định bằng cách đo mật độ quang của dung dịch tạo màu khi cĩ mặt thuốc thử DNS (3, 5 dinitro salicilic acid) tại bước sĩng 530nm.
Một đơn vị hoạt tính γ – amylase xúc tác thủy phân tinh bột, giải phĩng 1 μg glucose trong 1 phút, ở điều kiện nhiệt độ 450C, pH 5.
2.2.7.2. Cách tính
HđC =
Với: m: Hàm lượng glucose (μg/ml). L: Độ pha lỗng mẫu.
5: Thể tích dung dịch phản ứng (ml). t: thời gian phản ứng (10 phút).
HđC: hoạt độ chung γ – amylase (UI/g_CPE).
2.2.8. Định lượng protein hịa tan trong CPE theo phương pháp Lowry [12][26]
Phương pháp này dùng để xác định lượng protein hịa tan cĩ trong 1 gram chế phẩm enzyme (hay 1ml chế phẩm enzyme lỏng), từ đĩ xác định hoạt tính riêng của enzyme trên 1mg protein enzyme. Phương pháp này cũng được sử dụng để định lượng protein trong các nguyên liệu khác.
2.2.8.1. Nguyên tắc
Hầu hết các protein đều chứa Tyrosin và Tryptophan. Hàm lượng của những acid amin này tùy thuộc vào loại protein, vì vậy những protein cùng loại với nhau sẽ chứa hàm lượng acid amin này như nhau.
m. L. 5 t
Khi cho protein tác dụng với thuốc thử Folin sẽ tạo một phức chất cĩ màu, cường độ màu tỷ lệ với hàm lượng Tyrosin và Tryptophan, vì thế cĩ thể dùng phương pháp so màu để xác định hàm lượng protein. Phương pháp này cĩ độ nhạy cao, cho phép phát hiện được protein trong dung dịch ở nồng độ 1μg/ml.
2.2.8.2. Hĩa chất
Dung dịch albumin 0.1%: 0.1g albumin pha nước cất thành 100ml dung dịch. Dung dịch A: 2g Na2CO3 hịa tan trong NaOH N/10 thành 100ml dung dịch. Dung dịch B: cân 0.5g CuSO4 hịa tan trong dung dịch citrat natri 1% thành 100ml dung dịch.
Dung dịch C: chỉ pha để dùng ngay trong ngày gồm hỗn hợp của 2 dung dịch A và B theo tỷ lệ 49/1.
2.2.8.3. Cách tiến hành
Hút 0.4ml dung dịch cĩ chứa protein cho vào ống nghiệm sạch khơ, thêm 2ml dung dịch C, lắc đều và để yên ở nhiệt độ thường trong 10 phút. Sau đĩ thêm 0.2ml thuốc thử Folin vào, lắc đều trong 5-10 phút, thêm nước cất cho đủ 5ml, đem đo mật độ quang ở bước sĩng 520nm.
2.2.8.4. Cách tính * Dựng đường chuẩn * Dựng đường chuẩn
Thực hiện xây dựng đường chuẩn với một loại protein tinh khiết cĩ sẵn, thơng thường dùng albumin tinh khiết. Hút 0.4ml dung dịch albumin chuẩn cĩ nồng độ theo thứ tự: 0; 50; 100; 150; 200; 250 μg/ml vào các ống nghiệm sạch khơ đã đánh số phân biệt. Thực hiện phản ứng tương tự như trên. Muốn vậy phải thực hiện theo bảng sau để cĩ được các dung dịch albumin chuẩn với nồng độ khác nhau:
Ống nghiệm số 0 1 2 3 4 5
Nồng độ protein (μg/ml) 0 50 100 150 200 250
Dung dịch albumin 0.1% (ml) 0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5
Vẽ đồ thị biểu diễn sự biến thiên của mật độ quang ở bước sĩng 750nm (∆OD) theo nồng độ protein chuẩn (μg/ml).
* Tính kết quả
Từ đồ thị chuẩn, trên cơ sở giá trị mật độ quang (trục tung) đo được của mẫu thí nghiệm cĩ chứa protein cần xác định, ta suy ra hàm lượng protein của mẫu cần đo.
2.2.9. Xác định hoạt độ riêng của các chế phẩm enzyme [9]
Hoạt độ của chế phẩm enzyme được xác định theo cơng thức:
CPE CPE UI HđC / g HđR mg _ protein _ E / g mg _ protein _ E = = ∑
Với: + HđR: hoạt độ riêng. + HđC: hoạt độ chung.
+ ∑ĐVHđ: Số đơn vị hoạt độ enzyme/g CPE hay /ml CPE (∑UI/g hay ∑UI/ml).
+ C: mg protein/ml dung dịch enzyme hay /g CPE. + CPE: chế phẩm enzyme
+ UI: đơn vị hoạt độ enzyme.
+ ∑ UI: tổng đơn vị hoạt độ enzyme.
2.2.10. Lựa chọn phương pháp cố định γ-amylase [9][19]
2.2.10.1. Cố định γ-amylase lên màng chitosan bằng phương pháp cộng hĩa trị * Nguyên tắc * Nguyên tắc
Dựa vào liên kết cộng hĩa trị được hình thành giữa γ-amylase lên màng chitosan.
* Cách tiến hành
Dung dịch chitosan được chuẩn bị bằng cách hịa tan 1g chitosan trong 100ml acid acetic 1%. Sau đĩ đổ dung dịch chitosan 1% lên phiến kính phẳng và để khơ trong trong khơng khí trong tủ hút. Màng chitosan được ngâm trong dung dịch NaOH 0.1M/24h để trung hịa lượng acid dư. Sau đĩ màng được rửa nhiều lần với nước cất cho đến khi nước rửa trung tính và để khơ ở nhiệt độ phịng. Màng chitosan chuẩn cĩ bề dày khoảng 50μm.
1g chitosan tạo được 250m2
màng.
* Hoạt hĩa màng chitosan
Màng chitosan được ngâm và lắc trong dung dịch glutaraldehyde 2%/4h ở nhiệt độ phịng, rửa mẫu nhiều lần với nước cất nhằm loại hết dư lượng glutaraldehyde.
* Cố địnhγ-amylase lên màng chitosan bằng phương pháp cộng hĩa trị
Màng chitosan đã được hoạt hĩa bằng glutaraldehyde được ngâm và lắc với 50ml dung dịch đệm chứa 0.2g chế phẩm γ-amylase/1-5h ở nhiệt độ phịng. Tiếp tục dùng dung dịch đệm (với thể tích xác định) rửa màng chitosan đã cĩ enzyme cố định để loại bỏ các enzyme khơng gắn kết lên màng. Lượng protein cố định và hoạt tính γ-amylase được xác định gián tiếp qua lượng protein và tổng đơn vị hoạt độ E hiện diện trong nước rửa.
2.2.10.2. Cố định γ-amylase lên chất mang là Celite (Diatomite) bằng phương pháp hấp phụ [14] pháp hấp phụ [14]
* Nguyên tắc
Dựa vào khả năng hấp phụ γ-amylase lên chất mang Celite.
* Cách tiến hành
- Cân 0.2g enzyme pha thành 50ml với dung dịch hệ đệm pH 5.
- Cân 5g diatomite, cho từ từ vào 50ml dung dịch enzyme trên, khuấy hỗn hợp trong 30 phút ở 40C, lọc dịch lọc bằng giấy lọc.
- D ịch sau khi l
enzyme
* Cách tính hiệu suất gắn protein:
HScố định protein (%) =
(Hàm lượng Pr cố định = HLPr trước khi cố định – HLPr cịn trong dịch lọc)
Với: + HS: hiệu suất. + HL: hàm lượng.
+ Pr : protein.
* Cách tính hiệu suất hoạt độ enzyme γ-amylase cố định:
HS hoạt độ E cố định (%) = x100%
2.2.11. Phương pháp sử dụng γ-amylasecđ từ Asp. niger và thương mại để thủy
phân các loại tinh bột [12][15] * Nguyên tắc
Chế phẩm γ-amylase cố định trên chất mang phù hợp ở trên sẽ được dùng thủy phân tinh bột sắn và tinh bột bắp ở nhiệt độ 450
C và pH=5 với độ biến thiên thời gian là 30 phút. Khả năng thủy phân dựa vào lượng đường khử tạo thành.
* Cách tiến hành
Cho 20ml dung dịch cơ chất 2% vào erlen 100ml, thêm vào 20ml dung dịch đệm pH 5, rồi bổ sung lượng enzyme cố định, để trên bồn ổn nhiệt và giữ ổn định ở nhiệt độ 450C để thực hiện phản ứng thủy phân của γ-amylase trên cơ chất. Cứ mỗi 30 phút lấy ra 1ml đem xác định lượng đường khử tạo thành, từ đĩ xác định được thời gian phù hợp để cĩ lượng đường tối đa.
2.2.12. Phương pháp khảo sát khả năng tái sử dụng của CPEγ-amylasecđ * Nguyên tắc * Nguyên tắc
HL Pr cốđịnh
HL Pr trướckhi cốđịnh x 100
Quá trình thủy phân tinh bột bởi Ecđ được lặp lại nhiều lần trong bình chiết để hạn chế sự hao tổn Ecđ. Kết quả mỗi lần lặp lại được xác định qua lượng đường khử tạo thành.
* Cách tính
Từ kết quả thu được ở các lần tái sử dụng đem so sánh với kết quả ban đầu cĩ thể suy ra được số lần tái sử dụng của enzyme cố định.
2.2.13. Ứng dụng sản phẩm sau thủy phân tinh bột để lên men thu sinh khối nấm men [6], [9], [12] nấm men [6], [9], [12]
2.2.13.1. Thu nhận và định lượng glucose tạo thành trong dung dịch sau thủy phân tinh bột phân tinh bột
Từ kết quả thu được theo phương pháp 2.2.10 ta xác định được nồng độ α – glucose của dung dịch sau thủy phân tinh bột bằng γ-amylasecđ.
2.2.13.2. Lên men thu sinh khối giàu protein
Lấy dung dịch glucose tạo thành sau thủy phân tinh bột bằng γ-amylasecđ
điều chỉnh nồng độ đường và bổ sung cao nấm men, thanh trùng để làm nguyên liệu cho quá trình nuơi nấm men bởi chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae thương phẩm trong điều kiện hiếu khí, to = 25 – 35oC, pH = 3.5 để thu sinh khối giàu protein. Khi lượng sinh khối đạt 25 – 50g/l, ly tâm thu được bột nhão cĩ 15 – 20% chất khơ, sấy khơ đến độ ẩm 7% và nghiền bột để thu chế phẩm sinh khối giàu protein thơ. Nếu muốn thu protein ta cần phá tế bào, chiết thu dung dịch và kết tủa thu protein.
Với mục đích xác định điều kiện tối ưu để đạt lượng sinh khối tối đa chúng tơi tiến hành khảo sát thêm:
- Nồng độ đường phù hợp từ 4-12% (sau bổ sung đường). - Thời gian nuơi từ 2 – 6 ngày.
2.2.14. Phương pháp xử lý số liệu thực nghiệm [12]
Sử dụng cách tính xác suất thống kê để xử lý các số liệu thực nghiệm thu được.
2.2.14.1. Xác định giá trị trung bình
Giá trị trung bình của các số liệu là tổng giá trị thực của mỗi lần đo chia cho số lần đo. n i X .x n = ∑
Với: + x: giá trị trung bình. + xi: giá trị của một lần đo. + n : số lần đo
Nếu đo lặp lại nhiều lần trên một mẫu thí nghiệm thì ta cĩ thể tiệm cận đến một giá trị trung bình thật, nhưng thực tế khơng dễ đạt được điều này. Vì vậy, để giá trị trung bình của các lần đo như là một giá trị gần đúng với giá trị trung bình thật,
cần dùng phương pháp phân tích thống kê để đánh giá mức độ chính xác của các lần đo.
2.2.14.2. Tính tốn độ lệch mẫu và độ lệch chuẩn * Độ lệch mẫu: * Độ lệch mẫu:
Độ lệch mẫu là sự khác biệt giữa giá trị của một lần đo với giá trị trung bình. a = xi −x
Với: + a : độ lệch mẫu. + x: giá trị trung bình. + xi: giá trị của một lần đo.
* Độ lệch chuẩn:
Độ lệch chuẩn là sự sai số cĩ thể cĩ trong một lần thu thập số liệu với n lần đo. 2 i (x x) S n 1 − = − ∑
2.2.15. Phương pháp xây dựng đường chuẩn và hệ số gĩc a dựa trên phần mềm excel [4] excel [4]
Phương pháp này nhằm ứng dụng phần mềm Microsoft Excel để vẽ đường chuẩn và xác định nồng độ protein “C” của dung dịch protein cho tất cả các thí nghiệm, dùng các giá trị ∆OD và ứng dụng hàm Linest (∆OD, nồng độ) cĩ sẵn trong Excel để xác định hệ số gĩc “a”, từ đĩ xác định giá trị OD đường chuẩn theo cơng thức: OD C a ∆ =
Phần 3
Kết quả – Biện luận
PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN
3.1. Bảo quản giống và định danh nấm mốc Asp. niger
Chúng tơi nhận chủng giống cĩ kí hiệu AN2 do phịng thí nghiệm Bộ mơn Sinh hĩa trường Đại học Khoa học Tự nhiên cung cấp. Để thuận tiện cho các nghiên cứu phục vụ đề tài, sau khi hoạt hĩa giống, chúng tơi gửi mẫu tới phịng xét nghiệm NK – Biotek để định danh bằng sinh học phân tử đến lồi. Sau đĩ, chúng tơi tiến hành bảo quản chủng giống trên mơi trường thạch nghiêng PGA trong tủ lạnh 40
C theo phương pháp đã trình bày ở mục 2.2.1.
Kết quả giải trình tự 28S rRNA được tra cứu trên BLAST SEARCH cho thấy chủng AN2 thuộc lồi Aspergillus niger (phụ lục 5.5)
3.2. Kết quả quan sát đại thể và vi thể chủng giống Asp. niger
Tiến hành theo phương pháp đã trình bày ở mục 2.2.2.
Sau 4 ngày nuơi trên mơi trường Czapek Dox cải tiến tạo được một khuẩn lạc cĩ đường kính 46mm. Kết quả được thể hiện trong các hình 3.1; 3.2; 3.3; 3.4.
Hình 3.4: Hệ bào tử đính của Asp. niger
A: Bào tử đính; B: Bộ cuống đính bào tử; C: Sợi cuống
Hình 3.3: Khuẩn ty của Asp. niger
Hình 3.1: Mặt trước của khuẩn lạc Asp. niger
Hình 3.2: Mặt sau của khuẩn lạc Asp. niger
Mặt trước khuẩn lạc trịn, nhung mịn, bột rời, màu đen, viền mép màu trắng, khơng cĩ giọt tiết và sắc tố. Mặt sau cĩ màu vàng nhạt. Cĩ những nếp nhăn hướng tâm, tiết sắc tố màu vàng cam nhạt vào mơi trường. Sợi nấm cĩ vách ngăn, đa nhân, phân nhánh, khơng màu. Cuống sinh bào tử khơng phân nhánh, khối bào tử trần. Bào tử hình cầu, nhẵn, mịn. B A A: Sợi nấm; B: Vách ngăn ngang A B C
Nhận xét: Từ các quan sát đại thể và vi thể khẳng định chủng tuyển chọn từ trường Đại học Khoa học Tự nhiên là chủng Asp. niger.
3.3. Định lượng mật độ bào tử trực tiếp bằng buồng đếm hồng cầu
Tiến hành theo phương pháp đã trình bày ở mục 2.2.3. Kết quả thu được thể hiện trong bảng 3.1 và đồ thị 3.1.
Bảng 3.1 : Tương quan giữa mật độ bào tử và mật độ quang OD
OD610nm
Mật độ tế bào 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5
N (tế bào / ml) 737,5 x 104 887,5 x 104 1338 x 104 2250 x 104 2975 x 104
log (N) 6,87 6,95 7,13 7,35 7,47
Đồ thị 3.1: Tương quan tuyến tính giữa mật độ bào tử và OD
Nhận xét: Trong giai đoạn đầu của sự phát triển nấm mốc cĩ sự tương quan tuyến tính giữa mật độ bào tử và mật độ quang OD. Từ đĩ chọn mật độ bào tử phù hợp để thu sinh khối tế bào cao và hoạt độ E cao.
3.4. Xác định hoạt độ γ-amylase từ canh trường Asp. niger theo phương pháp so
màu DNS
3.4.1. Hoạt độ γ-amylase từ canh trường Asp. niger theo sự thay đổi thành
phần mơi trường
Enzyme γ- amylase sinh tổng hợp bởi nấm mốc Asp. niger là E cảm ứng với nguồn cơ chất tinh bột. Trong đề tài này, chúng tơi tiến hành khảo sát khả năng sinh
OD610nm L o g ( N /m l)
tổng hợp γ- amylase của nấm mốc Asp.niger với hai loại cơ chất cảm ứng là bột bắp và bột năng.
3.4.1.1. Ảnh hưởng thành phần mơi trường khi cơ chất cảm ứng là bột bắp
γ-amylase từ các mơi trường nuơi Asp. niger được xác định hoạt độ với sự thay đổi tỷ lệ giữa cám gạo và bột bắp trong thành phần mơi trường nuơi cấy theo các tỉ lệ 74/1 (g); 73/2 (g); 72/3 (g); 71/4 (g); 70/5 (g).
Phương pháp nuơi cấy và thu nhận CPE được trình bày ở mục 2.2.5.2. và 2.2.6. Kết quả được trình bày trong bảng 3.2 và biểu đồ 3.1.
Bảng 3.2: Hoạt độ γ-amylase từ các canh trường Asp. niger với cơ chất cảm ứng là bột
bắp Tỷ lệ cám gạo/bột bắp (gram) OD0 ODT ∆OD Nồng độ glucose (μg/ml) Hoạt độ (UI/gMT) TN 1 TN 2 TN 3 TN 1 TN 2 TN 3 74/1 0,468 0,477 0,465 0,713 0,698 0,708 0,235 4706 2118 73/2 0,614 0,643 0,659 0,920 0,983 0,958 0,315 6300 3780 72/3 0,785 0,800 0,811 1,070 1,094 1,073 0,280 5606 4205 71/4 1,040 1,062 1,034 1,498 1,492 1,470 0,435 8693 6085 70/5 0,714 0,743 0,658 1,043 1,056 1,025 0,336 6726 4036
Biểu đồ 3.1: Hoạt độ γ-amylase từ các mơi trường nuơi Asp. niger với cơ
chất cảm ứng là bột bắp
Nhận xét: Hoạt độ γ-amylase thu được từ canh trường nuơi cấy Asp. niger cĩ tỷ lệ cám gạo/bột bắp ≈ 71/4 (g) là cao nhất: 6085 (UI/gMT). Như vậy, khi bổ sung
Tỷ lệ cám gạo/bột bắp H oạt đ ộ ( U I/gC T) 73/ 74/ 72/ 71/ 70/
vào mơi trường nuơi nấm mốc cơ chất cảm ứng là bột bắp với tỉ lệ 4% chúng ta thu được hoạt độ γ-amylase là cao nhất.
3.4.1.2. Ảnh hưởng thành phần mơi trường khi cơ chất cảm ứng là bột năng
Enzyme γ-amylase từ các canh trường Asp. niger được xác định hoạt độ với sự thay đổi tỷ lệ giữa cám gạo và bột năng trong thành phần mơi trường nuơi cấy theo các tỉ lệ 74/1 (g); 73/2 (g); 72/3 (g); 71/4 (g); 70/5 (g).
Phương pháp nuơi cấy và thu nhận CPE được trình bày ở mục 2.2.5.2. và 2.2.6. Kết quả được trình bày trong bảng 3.3 và biểu đồ 3.2.
Bảng 3.3: Hoạt độ γ-amylase từ các canh trường Asp. niger với cơ chất cảm ứng là bột
năng Tỷ lệ cám gạo/bột năng (gram) OD0 ODT ∆OD Nồng độ glucose (μg/ml) Hoạt độ (UI/gMT) TN 1 TN 2 TN 3 TN 1 TN 2 TN 3 74/1 0,491 0,447 0,448 0,654 0,609 0,605 0,161 3213 1981 73/2 0,746 0,728 0,718 0,917 0,938 0,933 0,199 3973 2582