2.4.1 Xác định các chỉ tiêu vật lý
2.4.1.1 Phương pháp xác định pH
pH của tỏi được xác định theo phương pháp của Bae và cộng sự [10]. 10 g tỏi được đồng hóa trong 100 mL nước cất. Dung dịch tỏi sau khi đồng hóa được tiến hành đo pH sử dụng pH kế (pH meter để bàn CyberScan pH 1500, Singapore) ở nhiệt độ phòng.
2.4.1.2 Phương pháp xác định cường độ màu nâu
Cường độ màu nâu của tỏi được xác định theo phương pháp của Bae và cộng sự [10]. 10 g tỏi được đồng hóa trong 100 mL nước cất. Dung dịch tỏi sau khi đồng hóa được lọc bằng giấy lọc (hiệu GB/T1914 - 2007, kích cỡ là ∅ 11 cm), dung dịch lọc được sử dụng để đo cường độ màu nâu ở bước sóng 420nm (Spectrophotometry,
Carry 50, Varian, Mỹ). Sự thay đổi cường độ màu nâu của tỏi theo thời gian lên men được thể hiện bằng cường độ hấp thụ ánh sáng (Abs) ở bước sóng 420 nm.
2.4.2 Xác định các chỉ tiêu hóa học
2.4.2.1 Phương pháp xác định hàm lượng nước
Hàm lượng nước của tỏi được xác định bằng cách sấy mẫu ở nhiệt độ 103 ± 1 °C trong thời gian 4 giờ theo phương pháp ISO 6496:1999 [15] (Phụ lục 1).
2.4.2.2 Phương pháp xác định hàm lượng tro toàn phần
Hàm lượng tro toàn phần của tỏi được xác định bằng cách nung mẫu ở nhiệt độ 550 - 600 °C theo TCVN 7038:2002 nhằm mục đích đốt cháy hết các hợp chất hữu cơ [3]. Hàm lượng tro toàn phần được tính toán dựa vào phần khối lượng còn lại sau khi nung và khối lượng của mẫu trước khi nung (Phụ lục 2).
2.4.2.3 Phương pháp xác định hàm lượng đường tổng
Hàm lượng đường tổng trong tỏi được xác định bằng phương pháp Bertrand [3]. Phương pháp này dựa trên cơ sở trong môi trường kiềm (glucose, fructose và maltose) có thể dễ dàng khử đồng (II) oxide thành đồng (I) oxide có màu đỏ gạch, qua đó tính được hàm lượng đường khử (Phụ lục 5).
2.4.2.4 Phương pháp xác định hàm lượng protein hòa tan
Protein hòa tan trong tỏi chiết theo phương pháp của Kelleher và Hultin [16] với một vài điều chỉnh. 5 g tỏi được đồng hóa với 20mL nước cất sau đó đem li tâm ở tốc độ 4000 vòng/phút trong thời gian 15 phút (Hermile Z 323, Germany). Hàm lượng protein hòa tan trong dịch li tâm được xác định bằng phương pháp Biuret [28] với đường chuẩn được xây dựng từ BSA (Bovine Serum Albumin) (Phụ lục 3).
2.4.2.5 Phương pháp xác định hàm lượng lipid
Lipid trong tỏi được chiết bằng hỗn hợp chloroform và methanol theo phương pháp của Bligh và Dyer [12]. Hàm lượng lipid trong dịch chiết được xác
định bằng cách cân khối lượng lipid sau khi đuổi hết chloroform ở nhiệt độ 50-55
°C. Kết quả được thể hiện là % lipid theo khối lượng chất khô có trong tỏi (Phụ lục 4).
2.4.2.6 Phương pháp xác định hàm lượng Flavonoid
Hàm lượng flavonoid trong tỏi được xác định theo phương pháp so màu của Woisky và Salatino [32]. Cụ thể, 2g tỏi được đồng hóa với 20 mL methanol 80% và để ở nhiệt độ phòng trong thời gian 2 giờ. Sau đó dịch đồng hóa được li tâm ở tốc độ 4000 vòng/phút trong thời gian 15 phút (Hermile Z 323, Germany). Dịch li tâm được thu nhận và bổ sung methanol 80% cho đến khi đạt thể tích 45 mL. 1mL dịch li tâm được hòa trộn với 1 mL dung dịch AlCl3 2% trong ethanol, để ở nhiệt độ phòng trong thời gian 1 giờ. Cường độ hấp thụ ánh sáng được đo ở bước sóng 420 nm (Spectrophotometry, Carry 50, Varian, Mỹ). Hàm lượng flavonoid được tính toán từ đường chuẩn được xây dựng bằng rutin và kết quả được thể hiện là mg rutin tương đương (RE) trong 1 g sản phẩm.
2.5 PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU
Số liệu thực nghiệm thu được sẽ được tính toán tìm giá trị trung bình, độ lệch chuẩn và vẽ đồ thị trên phần mềm Mirosoft Exel 2010 (Microsoft Corporation, US). Các giá trị trung bình được so sánh dựa vào phân tích ANOVA và kiểm định Duncan (Duncan’s Multiple-Comparison Test) trên phần mềm NCSS 2000 (NCSS, Kaysville, Utah, USA). Khác biệt có ý nghĩa tại giá trị p < 0,05.
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1 SỰ BIẾN ĐỔI CHỈ TIÊU VẬT LÝ CỦA TỎI THEO THỜI GIAN LÊN MEN 3.1.1 Sự biến đổi pH của tỏi theo thời gian lên men 3.1.1 Sự biến đổi pH của tỏi theo thời gian lên men
Độ pH là một trong những chỉ tiêu hóa lý quan trọng để đánh giá sự hình thành các acid trong quá trình lên men, đồng thời độ pH có liên quan chặt chẽ đối với sự phát triển của vi sinh vật trong thực phẩm. Sự biến đổi pH của tỏi theo thời gian lên men được thể hiện ở Hình 3.1.
Hình 3.1. Sự biến đổi pH của tỏi theo thời gian lên men
Các chữ cái khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về pH của tỏi (p < 0,05)
Kết quả thu được cho thấy, pH của tỏi giảm dần theo thời gian lên men. Tuy nhiên, pH giảm mạnh từ ngày 0 đến ngày 5, sau đó giảm không đáng kể từ ngày 5 đến ngày 13 của quá trình lên men. Giá trị pH của tỏi nguyên liệu là 6,61; sau 13 ngày lên men, pH của tỏi đen là 4,11. Sự biến đổi pH từ ngày 0 đến ngày 5 giảm mạnh vì do trong thời gian đầu của quá trình lên men, những biến đổi về hóa lý diễn ra nhanh trong điều kiện nhiệt độ và độ ẩm lớn, dẫn đến sự hình thành các acid, đặc biệt dẫn đến sự hình thành acid cacboxylic (được sản xuất bởi quá trình ôxy hóa của nhóm aldehyde trong aldohexose, các hợp chất có tính acid và giảm các acid amin
0 1 2 3 4 5 6 7 8 0 1 3 5 7 9 11 13 p H
Thời gian lên men (ngày) a
b
c
d d d
cơ bản bằng cách kết hợp với đường) lớn dẫn đến pH giảm mạnh [10] [21]. Từ ngày 5 đến ngày 13 pH giảm với số lượng không đáng kể là do sự hình thành các acid giảm do tốc độ biến đổi các thành phần hóa lý giảm.
Trong một số nghiên cứu cũng đã chỉ ra rằng pH giảm trong thời gian lên men, điều này đã được chứng minh trong nghiên cứu của Bae và cộng sự [10], nghiên cứu này sử dụng tỏi đen được lên men ở các nhiệt độ khác nhau ở độ ẩm 70%. Kết quả thu được cho thấy pH giảm đáng kể khi tỏi được xử lý ở nhiệt độ cao, pH của tỏi sống là 6,42; sau khi lên men ở 40 °C và 85 °C trong vòng 45 ngày có giá trị pH tương ứng là 5,00 và 3,05 khi lên men 45 ngày ở nhiệt độ tương ứng là 40 °C và 85
°C. Kết quả nghiên cứu hoàn toàn phù hợp với một số kết qủa đã được công bố bởi một số tác giả khác như Choi và cộng sự [13] đã kết luận rằng pH trong tỏi đen giảm đáng kể từ từ 6,33 xuống 3,74; Shin và cộng sự [26] trong đó cho thấy pH của tỏi đen giảm 6,40 - 5,29 sau 6 ngày của quá trình lên men. Như vậy, so với các kết quả đã được công bố bới Bae và cộng sự [10]; Choi và cộng sự [13] và Shin và cộng sự [26] thì tốc độ giảm pH của tỏi trong nghiên cứu này nhanh hơn. Nguyên nhân có thể do sự khác nhau về loại tỏi, dẫn đến sự khác nhau về thành phần hóa học trong tỏi nguyên liệu. Ngoài ra, sự khác nhau về nhiệt độ và độ ẩm trong quá trình lên men cũng có ảnh hưởng không nhỏ đến tốc độ hình thành các acid làm giảm pH của tỏi.
3.1.2 Sự biến đổi cường độ màu nâu của tỏi theo thời gian lên men
Chất lượng của các sản phẩm thực phẩm không những bao hàm giá trị dinh dưỡng mà còn bao hàm cả giá trị cảm quan của chúng nữa. Màu sắc là một trong những chỉ số quan trọng của giá trị cảm quan. Màu sắc của thực phẩm không chỉ có giá trị về mặt hình thức mà còn có tác dụng sinh lý rất rõ rệt. Màu sắc thích hợp sẽ giúp cho cơ thể đồng hóa thực phẩm đó dễ dàng. Chính vì vậy, trong sản xuất tỏi đen cường độ màu nâu có ý nghĩa lớn trong việc quyết định đến giá trị của sản phẩm, sự biến đổi cường độ màu nâu được thể hiện trên Hình 3.2 và Hình 3.3.
Ngày lên
men Tỏi nguyên củ Tỏi đã cắt đôi củ
0
1
3
7
9
11
13
Hình 3.3. Sự biến đổi cường độ màu nâu của tỏi theo thời gian lên men
Các chữ cái khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về cường độ màu nâu của tỏi (p < 0,05)
Kết quả thu được cho thấy, cường độ màu nâu tăng dần theo thời gian lên men. Tuy nhiên, cường độ màu nâu có xu hướng tăng chậm từ ngày 0 đến ngày 7, sau đó tăng đột biến từ ngày 7 đến ngày 9; từ ngày 9 đến ngày 13 cường độ màu nâu của tỏi tăng chậm lại (Hình 3.3). Kết quả về sự biến đổi màu nâu của tỏi hoàn toàn phù hợp với sự thay đổi màu sắc bên trong của tỏi được thể hiện trên Hình 3.2. Sự biến đổi về cường độ màu nâu này là do phản ứng Maillard và phản ứng melanoidin, đây là phản ứng hóa nâu phi enzyme, cường độ sẫm màu phụ thuộc vào bản chất của acid amin, bản chất của đường, nồng độ chất khô với dung dịch, nhiệt độ, pH và một số yếu tố khác [10], [11]. Tỏi được lên men ở nhiệt độ cao (75 °C), đây là điều kiện thích hợp để xảy ra phản ứng hóa nâu giữa các acid amin và đường được hình thành trong quá trình lên men, đồng thời pH cũng là điều kiện cần thiết để phản ứng này được xảy ra [7]. Cường độ màu nâu tỉ lệ thuận với hàm lượng acid amin và đường theo thời gian lên men. Cường độ màu nâu tăng nhanh sau 9 ngày lên men là do trong giai đoạn đầu của quá trình lên men, trong điều kiện nhiệt độ
0 1 2 3 4 0 1 3 5 7 9 11 13 C ư ờ ng độ m àu nâ u ( A B S42 0 n m )
Thời gian lên men (ngày)
a a b c c c d d
cao thì phức đường amin bị đồng phân hóa hay còn gọi là bị chuyển vị nội phân Amadori, phẩm vật của sự chuyển vị Amadori là hợp chất có khả năng phản ứng và là chất khởi đầu để tạo thành polyme có màu sẫm, sau đó tiếp tục xảy ra phản ứng tạo furfurol và ozon, xảy ra sự phân hủy đường và phân hủy các hợp chất amin nên sự phản ứng tạo màu diễn ra mạnh nhờ sự tương tác giữa các acid amin và đường. Sau đó, từ ngày 9 đến ngày 13 cường độ màu tăng lên không đáng kể là do sự ngưng tụ alcol tạo thành polyme màu nâu không chứa nitơ và phản ứng trùng hợp hóa aldehitamin với sự tạo thành các hợp chất nitơ dị vòng, đây là giai đoạn cuối của phản ứng Maillard sẽ tạo nên các polyme không no hòa tan được trong nước, sau đến là các polyme không no và không hòa tan được trong nước, nhưng đều có màu đậm [7], [14]. Chính vì vậy, sản phẩm rỏi đen ngày 13 có màu nâu đậm hơn so với những ngày lên men trước đó. Sự tăng cao của cường độ màu nâu cũng đã được chứng minh trong đề tài nghiên cứu của Bae và cộng sự [10], kết quả cho thấy cường độ biến nâu của tỏi phụ thuộc vào nhiệt độ xử lý nhiệt. Nhiệt độ xử lý càng cao thi cường độ biến nâu càng nhanh [10], [11]. Nguyên nhân do tốc độ phản ứng biến nâu phi enzyme phụ thuộc rất lớn vào nhiệt độ [22], [23], [25]. Ngoài ra, các phản ứng hóa nâu cũng bị ảnh hưởng bởi hàm lượng nước của mẫu tỏi [18].
Tuy nhiên, tốc độ biến nâu của tỏi trong nghiên cứu này (từ 0,38 đến 3,44 sau 13 ngày lên men) diễn ra nhanh hơn so với tốc độ biến nâu của tỏi trong nghiên cứu của Bae và cộng sự (từ 0,69 đến 2,05 trong sau 45 ngày lên men) [10]. Nguyên nhân có thể do chế độ (nhiệt độ và độ ẩm) lên men khác nhau, thành phần hóa học của nguyên liệu tỏi ban đầu khác nhau. Hàm lượng nước ảnh hưởng đến năng lượng hoạt hóa phi enzyme màu nâu, và màu nâu phụ thuộc vào sự loại bỏ hàm lượng nước ở nhiêt độ cao. Xử lý nhiệt trong quá trình sản xuất tỏi đen tăng khả năng loại bỏ nước. Vì vậy tỏi lên men ở nhiệt độ cao được cho là tạo một năng lượng hoạt hóa tương đối cao cho màu nâu dựa trên sự thấp hơn của hàm lượng nước.
3.2 SỰ BIẾN ĐỔI CHỈ TIÊU HÓA HỌC CỦA TỎI THEO THỜI GIAN LÊN MEN LÊN MEN
3.2.1 Sự biến đổi hàm lượng nước của tỏi theo thời gian lên men
Giá trị thực phẩm cũng như tính chất cảm vị, độ bền của các sản phẩm thực phẩm là do thành phần các chất vô cơ và hữu cơ trong chúng quyết định, trong đó hàm lượng nước có ảnh hưởng lớn. Hàm lượng nước trong thực phẩm là một trong những nhân tố quan trọng ảnh hưởng đến màu sắc, mùi vị và độ bền của sản phẩm trong điều kiện nhiệt độ, pH… có thể ảnh hưởng đến sự phát triển nhanh của vi sinh vật. Đồng thời, việc xác định hàm lượng nước để tính được hàm lượng chất khô có chứa trong sản phẩm thực phẩm. Chính vì vậy, việc xác định hàm lượng nước là một chỉ tiêu hóa lý rất cần thiết. Sự biến đổi hàm lượng nước của tỏi theo thời gian lên men được thể hiện ở Hình 3.4.
Hình 3.4. Sự biến đổi hàm lượng nước của tỏi theo thời gian lên men
Các chữ cái khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về hàm lượng nước của tỏi (p < 0,05) 30 40 50 60 70 80 0 1 3 5 7 9 11 13 H àm l ư ợ ng nư ớ c (% )
Thời gian lên men (ngày) a
a
b b
b b b
Kết quả nghiên cứu cho thấy, hàm lượng nước của tỏi giảm dần theo thời gian lên men. Trong 3 ngày lên men đầu tiên, hàm lượng nước giảm nhanh sau đó giảm chậm hơn ở các ngày lên men tiếp theo. Từ ngày 11 đến ngày 13 của quá trình lên men, hàm lượng nước giảm nhanh. Sự biến đổi hàm lượng nước này là do trong giai đoạn đầu của quá trình lên men, hàm lượng nước chịu ảnh hưởng của nhiệt độ cao (75 °C trong 3 ngày đầu lên men), nhiệt độ cao tác động lên cấu trúc nguyên liệu làm cho nước trên bề mặt nguyên liệu đi ra, khi ở nhiệt độ cao thì nước trong nguyên liệu sẽ khuếch tán ra bề mặt và đi ra khỏi nguyên liệu làm cho hàm lượng nước của nguyên liệu giảm, vì vậy có sự giảm mạnh hàm lượng nước từ ngày 0 đến ngày 3. Sau đó, từ ngày 3 đến ngày 11 có sự thay đổi về nhiệt độ (65 °C) và hàm lượng ẩm cung cấp vào giảm xuống không nhiều nên sự biến đổi hàm lượng nước trong thời gian này không đáng kể. Từ ngày 11 đến ngày 13 là do có sự thay đổi điều kiện lên men (ở nhiệt độ 60 °C và độ ẩm tương đối 70%), sự khuếch tán hơi nước diễn ra nhanh nên trong thời gian này hàm lượng nước giảm tương đối lớn. Điều này đã được một số tác giả nghiên cứu và công bố, theo nghiên cứu của Bae và cộng sự [10], tỏi đen dùng trong nghiên cứu của Bae được lên men ở các nhiệt độ khác nhau (40, 55, 70 và 80 °C ) với hàm lượng nước tương đối là 70% trong vòng 45 ngày. Kết quả cho thấy, sau 45 ngày lên men hàm lượng nước của tỏi giảm từ 66,1% xuống còn 45,3-53,4%, nhiệt độ lên men càng lớn thì hàm lượng nước giảm càng nhanh.
Như vậy, dựa theo kết quả thu được và những nghiên cứu trước đó ta có thể kết luận rằng: Hàm lượng nước của tỏi giảm dần theo thời gian lên men trong điều kiện nhiệt độ cao. Tuy nhiên, sự biến đổi hàm lượng nước phụ thuộc vào điều kiện nhiệt độ và độ ẩm tương đối của môi trường không khí trong thời gian lên men.
3.2.2 Sự biến đổi hàm lượng tro của tỏi theo thời gian lên men
Tro là thành phần còn lại của thực phẩm sau khi nung cháy hết các chất hữu cơ. Tro thực sự chỉ gồm các loại muối khoáng có trong thực phẩm, muối khoáng có vai trò quan trọng đối với cơ thể của con người như: giữ vai trò quan trọng trong
các quá trình tạo hình, đặc biệt là tổ chức xương. Duy trì cân bằng acid, kiềm trong