2.1.1 Đối tượng nghiên cứu
Tỏi (Allium sativum) Phan Rang được dùng làm nguyên liệu trong nghiên cứu lên men sản xuất tỏi đen. Tỏi Phan Rang được mua tại chợ Vĩnh Hải, thành phố Nha Trang. Tỏi dùng để lên men không bị dập nát, sâu mọt, tỏi có lớp vỏ dày tỏi đưa vào chế biến là tỏi khô, thường có hàm lượng nước từ 50-60%.
Hình 2.1. Hình ảnh củ tỏi Phan Rang 2.1.2 Hóa chất, dụng cụ và thiết bị dùng trong nghiên cứu
2.1.2.1 Hóa chất
- Natri hydroxide tinh thể (NaOH), Chì acetate (Pb(CH3COO)2), Đồng sunfate tinh thể (CuSO4.5H2O), Sắt (III) sunfate tinh thể (Fe2(SO4)3), Acid sunfuric đậm đặc(H2SO4), Kali pemaganate (KMnO4).
- Methanol (CH3OH), Ethanol (C2H5OH), Nhôm clorua (AlCl3), Kali natri tartrate (KNaC4H4O6.4H2O), Clorofom, Kali clorua (KCl).
Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu đều thuộc loại tinh khiết được sử dụng cho phân tích.
2.1.2.2 Dụng cụ
- Bình tam giác 250 mL, 100 mL, 50 mL. - Bình định mức 500 mL, 250 mL, 100 mL. - Cốc thủy tinh 500 mL, 250 mL, 100 mL. - Ống đong 250 mL, 100 mL, 10 mL. - Ống nghiệm thủy tinh.
- Ống Falcon đựng mẫu 50 mL. - Ống nhựa ly tâm 50 mL. - Pipet 10 mL, 5 mL, 2 mL. - Cuvet thạch anh. - Micropipet (10 - 100 , 100 – 500 , 100 - 1000 , 1 – 5 mL). 2.1.2.3 Thiết bị phân tích
- Máy ly tâm (Hermile Z 323, Germany, Germany).
- Máy đo quang phổ UV - VIS (Spectrophotometry, Carry 50, Varian, Mỹ). - Máy vortex.
- Bể ổn nhiệt (Elma, S300H, Elmasonic, Germany).
- Máy đo pH (pH meter để bàn CyberScan pH 150, Singapore). - Cân phân tích (OCE – Germany).
- Tủ sấy vuông (Nhiệt độ sấy 0 - 300°C, China).
2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1 Sơ đồ quy trình tổng quát lên men sản xuất tỏi đen
Quy trình lên men sản xuất tỏi đen tổng quát được thể hiện trên Hình 2.2.
Hình 2.2. Sơ đồ quy trình tổng quát lên men sản xuất tỏi đen Thuyết minh quy trình
Tỏi nguyên liệu: Tỏi sử dụng trong lên men phải là tỏi không bị dập nát, sâu mọt.
Xử lý: Tỏi nguyên liệu được lựa chọn những củ đạt chất lượng để đi lên men. Lên men: Tỏi sau khi được lựa chọn, được xếp vào các khay và đi lên men
trong điều kiện nhiệt độ, độ ẩm được kiểm soát trong khoảng thời gian nhất định.
Sấy khô: Sau khi lên men, tỏi đen được sấy khô đến hàm lượng nước đạt khoảng 30%.
Tỏi nguyên liệu
Xử lý
Lên men
Sấy khô
Bao gói
Bao gói: Sau khi sấy khô, tỏi được để nguội và cho vào túi PA, hút chân không và đem đi bảo quản.
Bảo quản: Tỏi đen sau khi bao gói được bảo quản lạnh ở nhiệt độ 2 - 4 °C
2.2.2. Sơ bố trí thí nghiệm nghiên cứu
Sơ đồ bố trí thí nghiệm nghiên cứu sự biến đổi thành phần hóa lý của tỏi theo thời gian lên men được thể hiện trên Hình 2.3.
Hình 2.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm nghiên cứu sự biến đổi thành phần hóa lý của tỏi theo thời gian lên men
Tỏi nguyên liệu
Xử lý
Lên men
Lấy mẫu phân tích
Chỉ tiêu vật lý Chỉ tiêu hóa học
pH Cường độ màu nâu Hàm lượng nước và tro Hàm lượng đường tổng Hàm lượng lipid Hàm lượng protein hòa tan Hàm lượng flavonoid Điều chỉnh nhiệt độ và độ ẩm
Giải thích quy trình
Tỏi nguyên liệu được loại bỏ đất, cát và các củ không đảm bảo chất lượng (tép tỏi bị dập, bị thối,...) trước khi xếp vào khay inox và tiến hành lên men. Tỏi được lên men ở các chế độ nhiệt độ và độ ẩm khác nhau trong thời gian 13 ngày. Trong thời gian 3 ngày đầu tiên của quá trình lên men, tỏi được giữ ở nhiệt độ 75 °C và độ ẩm tương đối là 90%. Trong 4 ngày lên men tiếp theo, tỏi được giữ ở nhiệt độ 65 °C và độ ẩm tương đối 80%. Trong thời gian 6 ngày lên men cuối cùng, tỏi được duy trì ở nhiệt độ 60 °C và độ ẩm tương đối 70%. Trong thời gian lên men, mẫu tỏi được thu nhận ở các ngày 0, 1, 3, 5, 7, 9, 11 và 13 để tiến hành đánh giá sự biến đổi các thành phần hóa lý theo sơ đồ bố trí thí nghiệm được thể hiện ở Hình 2.3..
2.3 PHƯƠNG PHÁP CHUẨN BỊ MẪU PHÂN TÍCH
Khoảng 100 g (15 - 20 củ) tỏi được thu nhận theo thời gian lên men. Các mẫu tỏi được bóc sạch vỏ, đồng hóa và bảo quản trong các ống Falcon 50 mL ở nhiệt độ 4 °C trước khi tiến hành phân tích.
2.4 PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH 2.4.1 Xác định các chỉ tiêu vật lý 2.4.1 Xác định các chỉ tiêu vật lý
2.4.1.1 Phương pháp xác định pH
pH của tỏi được xác định theo phương pháp của Bae và cộng sự [10]. 10 g tỏi được đồng hóa trong 100 mL nước cất. Dung dịch tỏi sau khi đồng hóa được tiến hành đo pH sử dụng pH kế (pH meter để bàn CyberScan pH 1500, Singapore) ở nhiệt độ phòng.
2.4.1.2 Phương pháp xác định cường độ màu nâu
Cường độ màu nâu của tỏi được xác định theo phương pháp của Bae và cộng sự [10]. 10 g tỏi được đồng hóa trong 100 mL nước cất. Dung dịch tỏi sau khi đồng hóa được lọc bằng giấy lọc (hiệu GB/T1914 - 2007, kích cỡ là ∅ 11 cm), dung dịch lọc được sử dụng để đo cường độ màu nâu ở bước sóng 420nm (Spectrophotometry,
Carry 50, Varian, Mỹ). Sự thay đổi cường độ màu nâu của tỏi theo thời gian lên men được thể hiện bằng cường độ hấp thụ ánh sáng (Abs) ở bước sóng 420 nm.
2.4.2 Xác định các chỉ tiêu hóa học
2.4.2.1 Phương pháp xác định hàm lượng nước
Hàm lượng nước của tỏi được xác định bằng cách sấy mẫu ở nhiệt độ 103 ± 1 °C trong thời gian 4 giờ theo phương pháp ISO 6496:1999 [15] (Phụ lục 1).
2.4.2.2 Phương pháp xác định hàm lượng tro toàn phần
Hàm lượng tro toàn phần của tỏi được xác định bằng cách nung mẫu ở nhiệt độ 550 - 600 °C theo TCVN 7038:2002 nhằm mục đích đốt cháy hết các hợp chất hữu cơ [3]. Hàm lượng tro toàn phần được tính toán dựa vào phần khối lượng còn lại sau khi nung và khối lượng của mẫu trước khi nung (Phụ lục 2).
2.4.2.3 Phương pháp xác định hàm lượng đường tổng
Hàm lượng đường tổng trong tỏi được xác định bằng phương pháp Bertrand [3]. Phương pháp này dựa trên cơ sở trong môi trường kiềm (glucose, fructose và maltose) có thể dễ dàng khử đồng (II) oxide thành đồng (I) oxide có màu đỏ gạch, qua đó tính được hàm lượng đường khử (Phụ lục 5).
2.4.2.4 Phương pháp xác định hàm lượng protein hòa tan
Protein hòa tan trong tỏi chiết theo phương pháp của Kelleher và Hultin [16] với một vài điều chỉnh. 5 g tỏi được đồng hóa với 20mL nước cất sau đó đem li tâm ở tốc độ 4000 vòng/phút trong thời gian 15 phút (Hermile Z 323, Germany). Hàm lượng protein hòa tan trong dịch li tâm được xác định bằng phương pháp Biuret [28] với đường chuẩn được xây dựng từ BSA (Bovine Serum Albumin) (Phụ lục 3).
2.4.2.5 Phương pháp xác định hàm lượng lipid
Lipid trong tỏi được chiết bằng hỗn hợp chloroform và methanol theo phương pháp của Bligh và Dyer [12]. Hàm lượng lipid trong dịch chiết được xác
định bằng cách cân khối lượng lipid sau khi đuổi hết chloroform ở nhiệt độ 50-55
°C. Kết quả được thể hiện là % lipid theo khối lượng chất khô có trong tỏi (Phụ lục 4).
2.4.2.6 Phương pháp xác định hàm lượng Flavonoid
Hàm lượng flavonoid trong tỏi được xác định theo phương pháp so màu của Woisky và Salatino [32]. Cụ thể, 2g tỏi được đồng hóa với 20 mL methanol 80% và để ở nhiệt độ phòng trong thời gian 2 giờ. Sau đó dịch đồng hóa được li tâm ở tốc độ 4000 vòng/phút trong thời gian 15 phút (Hermile Z 323, Germany). Dịch li tâm được thu nhận và bổ sung methanol 80% cho đến khi đạt thể tích 45 mL. 1mL dịch li tâm được hòa trộn với 1 mL dung dịch AlCl3 2% trong ethanol, để ở nhiệt độ phòng trong thời gian 1 giờ. Cường độ hấp thụ ánh sáng được đo ở bước sóng 420 nm (Spectrophotometry, Carry 50, Varian, Mỹ). Hàm lượng flavonoid được tính toán từ đường chuẩn được xây dựng bằng rutin và kết quả được thể hiện là mg rutin tương đương (RE) trong 1 g sản phẩm.
2.5 PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU
Số liệu thực nghiệm thu được sẽ được tính toán tìm giá trị trung bình, độ lệch chuẩn và vẽ đồ thị trên phần mềm Mirosoft Exel 2010 (Microsoft Corporation, US). Các giá trị trung bình được so sánh dựa vào phân tích ANOVA và kiểm định Duncan (Duncan’s Multiple-Comparison Test) trên phần mềm NCSS 2000 (NCSS, Kaysville, Utah, USA). Khác biệt có ý nghĩa tại giá trị p < 0,05.
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1 SỰ BIẾN ĐỔI CHỈ TIÊU VẬT LÝ CỦA TỎI THEO THỜI GIAN LÊN MEN 3.1.1 Sự biến đổi pH của tỏi theo thời gian lên men 3.1.1 Sự biến đổi pH của tỏi theo thời gian lên men
Độ pH là một trong những chỉ tiêu hóa lý quan trọng để đánh giá sự hình thành các acid trong quá trình lên men, đồng thời độ pH có liên quan chặt chẽ đối với sự phát triển của vi sinh vật trong thực phẩm. Sự biến đổi pH của tỏi theo thời gian lên men được thể hiện ở Hình 3.1.
Hình 3.1. Sự biến đổi pH của tỏi theo thời gian lên men
Các chữ cái khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về pH của tỏi (p < 0,05)
Kết quả thu được cho thấy, pH của tỏi giảm dần theo thời gian lên men. Tuy nhiên, pH giảm mạnh từ ngày 0 đến ngày 5, sau đó giảm không đáng kể từ ngày 5 đến ngày 13 của quá trình lên men. Giá trị pH của tỏi nguyên liệu là 6,61; sau 13 ngày lên men, pH của tỏi đen là 4,11. Sự biến đổi pH từ ngày 0 đến ngày 5 giảm mạnh vì do trong thời gian đầu của quá trình lên men, những biến đổi về hóa lý diễn ra nhanh trong điều kiện nhiệt độ và độ ẩm lớn, dẫn đến sự hình thành các acid, đặc biệt dẫn đến sự hình thành acid cacboxylic (được sản xuất bởi quá trình ôxy hóa của nhóm aldehyde trong aldohexose, các hợp chất có tính acid và giảm các acid amin
0 1 2 3 4 5 6 7 8 0 1 3 5 7 9 11 13 p H
Thời gian lên men (ngày) a
b
c
d d d
cơ bản bằng cách kết hợp với đường) lớn dẫn đến pH giảm mạnh [10] [21]. Từ ngày 5 đến ngày 13 pH giảm với số lượng không đáng kể là do sự hình thành các acid giảm do tốc độ biến đổi các thành phần hóa lý giảm.
Trong một số nghiên cứu cũng đã chỉ ra rằng pH giảm trong thời gian lên men, điều này đã được chứng minh trong nghiên cứu của Bae và cộng sự [10], nghiên cứu này sử dụng tỏi đen được lên men ở các nhiệt độ khác nhau ở độ ẩm 70%. Kết quả thu được cho thấy pH giảm đáng kể khi tỏi được xử lý ở nhiệt độ cao, pH của tỏi sống là 6,42; sau khi lên men ở 40 °C và 85 °C trong vòng 45 ngày có giá trị pH tương ứng là 5,00 và 3,05 khi lên men 45 ngày ở nhiệt độ tương ứng là 40 °C và 85
°C. Kết quả nghiên cứu hoàn toàn phù hợp với một số kết qủa đã được công bố bởi một số tác giả khác như Choi và cộng sự [13] đã kết luận rằng pH trong tỏi đen giảm đáng kể từ từ 6,33 xuống 3,74; Shin và cộng sự [26] trong đó cho thấy pH của tỏi đen giảm 6,40 - 5,29 sau 6 ngày của quá trình lên men. Như vậy, so với các kết quả đã được công bố bới Bae và cộng sự [10]; Choi và cộng sự [13] và Shin và cộng sự [26] thì tốc độ giảm pH của tỏi trong nghiên cứu này nhanh hơn. Nguyên nhân có thể do sự khác nhau về loại tỏi, dẫn đến sự khác nhau về thành phần hóa học trong tỏi nguyên liệu. Ngoài ra, sự khác nhau về nhiệt độ và độ ẩm trong quá trình lên men cũng có ảnh hưởng không nhỏ đến tốc độ hình thành các acid làm giảm pH của tỏi.
3.1.2 Sự biến đổi cường độ màu nâu của tỏi theo thời gian lên men
Chất lượng của các sản phẩm thực phẩm không những bao hàm giá trị dinh dưỡng mà còn bao hàm cả giá trị cảm quan của chúng nữa. Màu sắc là một trong những chỉ số quan trọng của giá trị cảm quan. Màu sắc của thực phẩm không chỉ có giá trị về mặt hình thức mà còn có tác dụng sinh lý rất rõ rệt. Màu sắc thích hợp sẽ giúp cho cơ thể đồng hóa thực phẩm đó dễ dàng. Chính vì vậy, trong sản xuất tỏi đen cường độ màu nâu có ý nghĩa lớn trong việc quyết định đến giá trị của sản phẩm, sự biến đổi cường độ màu nâu được thể hiện trên Hình 3.2 và Hình 3.3.
Ngày lên
men Tỏi nguyên củ Tỏi đã cắt đôi củ
0
1
3
7
9
11
13
Hình 3.3. Sự biến đổi cường độ màu nâu của tỏi theo thời gian lên men
Các chữ cái khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về cường độ màu nâu của tỏi (p < 0,05)
Kết quả thu được cho thấy, cường độ màu nâu tăng dần theo thời gian lên men. Tuy nhiên, cường độ màu nâu có xu hướng tăng chậm từ ngày 0 đến ngày 7, sau đó tăng đột biến từ ngày 7 đến ngày 9; từ ngày 9 đến ngày 13 cường độ màu nâu của tỏi tăng chậm lại (Hình 3.3). Kết quả về sự biến đổi màu nâu của tỏi hoàn toàn phù hợp với sự thay đổi màu sắc bên trong của tỏi được thể hiện trên Hình 3.2. Sự biến đổi về cường độ màu nâu này là do phản ứng Maillard và phản ứng melanoidin, đây là phản ứng hóa nâu phi enzyme, cường độ sẫm màu phụ thuộc vào bản chất của acid amin, bản chất của đường, nồng độ chất khô với dung dịch, nhiệt độ, pH và một số yếu tố khác [10], [11]. Tỏi được lên men ở nhiệt độ cao (75 °C), đây là điều kiện thích hợp để xảy ra phản ứng hóa nâu giữa các acid amin và đường được hình thành trong quá trình lên men, đồng thời pH cũng là điều kiện cần thiết để phản ứng này được xảy ra [7]. Cường độ màu nâu tỉ lệ thuận với hàm lượng acid amin và đường theo thời gian lên men. Cường độ màu nâu tăng nhanh sau 9 ngày lên men là do trong giai đoạn đầu của quá trình lên men, trong điều kiện nhiệt độ
0 1 2 3 4 0 1 3 5 7 9 11 13 C ư ờ ng độ m àu nâ u ( A B S42 0 n m )
Thời gian lên men (ngày)
a a b c c c d d
cao thì phức đường amin bị đồng phân hóa hay còn gọi là bị chuyển vị nội phân Amadori, phẩm vật của sự chuyển vị Amadori là hợp chất có khả năng phản ứng và là chất khởi đầu để tạo thành polyme có màu sẫm, sau đó tiếp tục xảy ra phản ứng tạo furfurol và ozon, xảy ra sự phân hủy đường và phân hủy các hợp chất amin nên sự phản ứng tạo màu diễn ra mạnh nhờ sự tương tác giữa các acid amin và đường. Sau đó, từ ngày 9 đến ngày 13 cường độ màu tăng lên không đáng kể là do sự ngưng tụ alcol tạo thành polyme màu nâu không chứa nitơ và phản ứng trùng hợp hóa aldehitamin với sự tạo thành các hợp chất nitơ dị vòng, đây là giai đoạn cuối của phản ứng Maillard sẽ tạo nên các polyme không no hòa tan được trong nước, sau đến là các polyme không no và không hòa tan được trong nước, nhưng đều có màu đậm [7], [14]. Chính vì vậy, sản phẩm rỏi đen ngày 13 có màu nâu đậm hơn so với những ngày lên men trước đó. Sự tăng cao của cường độ màu nâu cũng đã được chứng minh trong đề tài nghiên cứu của Bae và cộng sự [10], kết quả cho thấy cường độ biến nâu của tỏi phụ thuộc vào nhiệt độ xử lý nhiệt. Nhiệt độ xử lý càng cao thi cường độ biến nâu càng nhanh [10], [11]. Nguyên nhân do tốc độ phản ứng biến nâu phi enzyme phụ thuộc rất lớn vào nhiệt độ [22], [23], [25]. Ngoài ra, các phản ứng hóa nâu cũng bị ảnh hưởng bởi hàm lượng nước của mẫu tỏi [18].
Tuy nhiên, tốc độ biến nâu của tỏi trong nghiên cứu này (từ 0,38 đến 3,44 sau 13 ngày lên men) diễn ra nhanh hơn so với tốc độ biến nâu của tỏi trong nghiên cứu của Bae và cộng sự (từ 0,69 đến 2,05 trong sau 45 ngày lên men) [10]. Nguyên nhân