c. Nhận xét đối với sinh viên tham gia thực hiện đề tài:
3.3 Quy trình chiết suất cao
3.3.1 Thu hái
Dƣợc liệu thu hái chọn cây già, có hoa, quả, sau khi thu hái về đƣợc lựa kỹ, bỏ các bộ phận bị sâu bệnh, vàng héo, loại tạp, rửa sạch với nƣớc (giống nhƣ rửa rau), để ráo, cắt khúc khoảng 3cm, làm khô tự nhiên trong mát, thoáng gió thƣờng xuyên đảo trộn và tránh không để cây chồng đống, dồn nén lên nhau có thể làm phát sinh nấm mốc, sau 5 – 7 ngày đạt độ ẩm < 13%.
Chương 3 Thực nghiệm
Nguyễn Lê Lịnh 21
Tất cả các loại dƣợc liệu sau khi sơ chế, làm khô đến độ ẩm cần thiết đƣợc cất kỹ trong túi nylon dày, buộc chặt để tránh hút ẩm, một phần xay nhuyễn (khoảng 100g) để tiến hành những thí nghiệm liên quan.
Mẫu tƣơi các loại dƣợc liệu đã đƣợc ThS Nguyễn Thị Kim Huê, Bộ môn Sinh học, khoa Khoa Học Tự Nhiên định danh trên cơ sở sách Cây cỏ Việt Nam tập 1, 2, 3 của tác giả Phạm Hoàng Hộ, năm 2003.
3.3.2 Đánh giá nguyên liệu [11]
3.3.2.1 Xác định độ ẩm
Độ ẩm (mất khối lƣợng do làm khô) là sự giảm khối lƣợng của mẫu thử biểu thị bằng phần trăm (kl/kl) khi đƣợc làm khô trong điều kiện xác định ở mỗi chuyên luận. Phƣơng pháp này dùng để xác định hàm lƣợng nƣớc, một phần hoặc toàn bộ lƣợng nƣớc kết tinh và lƣợng chất dể bay hơi khác trong mẫu thử.
Cách tiến hành: Rửa sạch 4 cốc sứ có nắp 40mm, sấy khô trong tủ sấy ở nhiệt độ 105°C đến khối lƣợng không đổi rồi đem cân (a). Cân 3g mẫu cho vào cốc đặt vào tủ sấy, sấy ở nhiệt độ 105°C trong 4 giờ, lấy cốc ra cho vào bình hút ẩm đến nhiệt độ phòng rồi đem cân. Tiếp tục sấy nhƣ trên sau 2 giờ cân một lần đến khối lƣợng không đổi (b). Độ ẩm của mẫu đƣợc xác định theo công thức:
3 100 3 b a P
Trong đó: P: độ ẩm của mẫu thử (%) a: khối lƣợng cốc sứ (g)
b: cốc và mẫu khi làm khô đến khối lƣợng không đổi (g).
Thực hiện thí nghiệm 1 lần trên mỗi mẫu dƣợc liệu, lấy kết quả trung bình.
Chương 3 Thực nghiệm
Nguyễn Lê Lịnh 22
Bảng 3.1: Kết quả xác định độ ẩm dƣợc liệu
Dƣợc liệu Lạc tiên Lá Sen Vông nem Trinh nữ
Độ ẩm (%) 12,8 12,5 12,5 12,3
3.3.2.2 Xác định tro toàn phần
Cách tiến hành: Lấy một chén sứ hoặc chén platin nung tới đỏ trong 30 phút. Để nguội trong bình hút ẩm rồi cân. Lấy 1g mẫu thử rải đều vào chén nung, sấy 1 giờ ở 100 – 105°C rồi nung trong lò nung ở 600 25°C. Sau mỗi lần nung, lấy chén nung cùng cắn tro đem làm nguội trong bình hút ẩm rồi cân. Trong quá trình thao tác không đƣợc để tạo thành ngọn lửa. Nếu sau khi đã nung lâu mà vẫn chƣa loại hết carbon của tro thì dùng nƣớc nóng để lấy cắn ra, lọc qua giấy lọc không tro rồi lại nung cắn và giấy lọc trong chén nung. Hợp dịch lọc vào tro ở trong chén. Làm bốc hơi cẩn thận tới khô rồi nung đến khối lƣợng không đổi.
Hình 3.6 Xác định tro toàn phần Bảng 3.2: Kết quả xác định tro toàn phần
Dƣợc liệu Trinh nữ Vông nem Lá Sen Lạc tiên
Hàm lƣợng tro (%) 2,3 1,6 2,1 1,8
3.3.2.3 Định tính
a) Định tính alcaloid - Thuốc thử định tính alcaloid
Chương 3 Thực nghiệm
Nguyễn Lê Lịnh 23
Cho kết tủa nâu với dung dịch chứa alcaloid.
Thuốc thử Mayer: HgCl2 (6,8g), KI (2,5g), nƣớc cất (500ml). Cho kết tủa trắng hoặc vàng nhạt với dung dịch chứa alcaloid.
Thuốc thử Dragendorff:
Dung dịch A: Bi(NO3)3 (0,85g), acid acetic (10ml), nƣớc cất (40ml). Dung dịch B: KI (5g), nƣớc cất (40ml).
Khi sử dụng trộn đều dung dịch A và dung dịch B. Kết quả dƣơng tính nếu xuất hiện tủa màu vàng cam.
Dung dịch sắt (III) clorid 5%.
- Thực nghiệm Bột dƣợc liệu 5g Chiết hoàn lƣu Lọc Chiết lỏng - lỏng Định tính Thấm ẩm NH3 10% CHCl3 20ml Acid HCl 1% 5ml x 3 lần Hình 3.7 Quy trình định tính alcaloid
Thuyết minh quy trình
Lấy 5g bột dƣợc liệu cho vào bình nón cổ nhám 100ml, thấm ẩm bằng NH3
10%, rồi cho vào bình 20ml cloroform, lắc nhẹ và đun sôi trên bếp cách thủy 2 – 3 phút. Lọc vào bình gạn qua giấy lọc đã thấm bằng cloroform, lắc 3 lần, mỗi lần 5ml dung dịch acid hydrochloric 1%. Để yên cho dung dịch tách thành 2 lớp, gạn lấy lớp
Chương 3 Thực nghiệm
Nguyễn Lê Lịnh 24
acid. Gộp dịch chiết chia thành 4 ống nghiệm dùng để thử nghiệm với các loại thuốc thử Wagner, Mayer, Dragendorff .
b) Định tính saponin [9]
Tính tạo bọt là tính chất đặc trƣng của saponin, tôi căn cứ vào tính tạo bọt để xác định sự hiện diện của saponin.
Dƣợc điển Pháp định nghĩa chỉ số tạo bọt nhƣ sau: chỉ số tạo bọt là độ pha loảng của nƣớc sắc nguyên liệu có cột bọt cao 1cm, sau khi lắc ống nghiệm tiến hành trong điều kiện quy định.
Thực nghiệm: Đun sôi 1g bột nguyên liệu trong 100ml nƣớc cất khoảng 30 phút. Lọc, để nguội, thêm nƣớc cất lại cho đủ 100ml.
Sử dụng 10 ống nghiệm có chiều cao 16cm, đƣờng kính 16mm. Cho vào ống nghiệm lần lƣợt 1, 2, 3,…, 10ml dịch chiết. Thêm nƣớc cất vào cho đủ 10ml. Bịt miệng ống nghiệm, lắc theo chiều dọc của ống nghiệm trong 15 giây, mỗi giây lắc 2 lần. Để yên 15 phút, đo chiều cao các cột bọt. Nếu cột bọt trong tất cả các ống dƣới 1cm, chỉ số bọt dƣới 100, tức là không có saponin.
Ví dụ: Nếu ống thứ 4 có độ bọt cao 1cm thì chỉ số bọt đƣợc tính nhƣ sau: Chỉ số bọt 10 1 100
0, 01 4
Nếu ống số 1 và số 2 có cột bọt cao 1cm thì cần pha loãng để có chỉ số bọt chính xác. Nếu cột bọt của tất cả các ống nghiệm đều lớn hơn 1cm thì cần phải pha loãng hơn và làm lại thí nghiệm
c) Định tính flavonoid - Tác dụng với H2SO4 đặc
Hòa tan hợp chất flavonoid vào H2SO4 đặc. Flavon và flavonol cho màu vàng đậm đến màu cam và phát huỳnh quang đặc biệt. Chalcon, auron cho màu đỏ hoặc xanh dƣơng – đỏ. Flavanonn cho màu từ cam đến đỏ.
- Tác dụng với dung dịch 1% NaOH/Etanol
Nhỏ dung dịch 1% NaOH/Etanol vào một dung dịch flavonoid, sẽ có màu từ vàng đến cam đỏ. Nếu là flavon, isoflavon, isoflavanon, flavanon, chalcon, leucoantocyanidin sẽ có màu vàng. Flavonol màu từ vàng đến cam. Auron cho màu từ đỏ đến đỏ tím.
Chương 3 Thực nghiệm Nguyễn Lê Lịnh 25 3.3.2.4 Định lượng a) Trinh nữ Bột Dƣợc liệu 10g Đun cách thủy Lọc Bốc hơi tạo cắn Chiết CHCl3 5x10ml Làm khan Lọc Bốc hơi Sấy Cân Etanol 96° 3 x 100ml HCl 1% 3 x 10ml Kiềm hóa bằng NH3 đặc
Hình 3.8 Quy trình định lƣợng alcaloid trong cây Trinh nữ
Thuyết minh quy trình
Cân chính xác 10g bột dƣợc liệu cho vào bình nón 250ml, thêm 100ml etanol 90°, đun hồi lƣu cách thủy trong 30 phút. Lọc qua bông. Làm lại nhƣ trên vài lần cho đến khi kiệt alcaloid. Gộp toàn bộ dịch chiết, bốc hơi dung môi đến cắn. Hòa tan cắn với dung dịch acid hydrochloric 1% (3 lần, mỗi lần 10ml). Lọc dịch acid này vào bình gạn, rửa bông với một ít dung dịch acid hydrochloric 1%. Kiềm hóa dịch acid này bằng ammoniac đặc đến pH = 10. Sau đó, chiết lại bằng cloroform 5
Chương 3 Thực nghiệm
Nguyễn Lê Lịnh 26
lần, mỗi lần 10ml. Gộp toàn bộ dịch chiết cloroform, làm khan bằng natri sulfat khan, lọc vào chén cân khô đã cân bì trƣớc. Bay hơi đến cắn, sấy ở 100°C đến khối lƣợng không đổi và đem cân.
b) Vông nem (lá) Bột Dƣợc liệu 10g Đun cách thủy Lọc Bốc hơi tạo cắn Chiết CHCl3 5x10ml Làm khan Lọc Bốc hơi Sấy Cân Etanol 96° 3x 100ml H2SO4 2% 3 x 10ml Kiềm hóa bằng NH3 đặc
Hình 3.9 Quy trình định lƣợng alcaloid trong lá Vông nem
Thuyết minh quy trình
Cân chính xác 10g bột dƣợc liệu cho vào bình nón 250ml, thêm 100ml etanol 90°, đun hồi lƣu cách thủy trong 30 phút. Lọc qua bông. Làm lại nhƣ trên vài lần cho đến khi kiệt alcaloid. Gộp toàn bộ dịch chiết, bốc hơi dung môi đến cắn. Hòa
Chương 3 Thực nghiệm
Nguyễn Lê Lịnh 27
tan cắn với dung dịch acid sulfuric 2% (3 lần, mỗi lần 10ml). Lọc dịch acid này vào bình gạn, rửa bông với một ít dung dịch acid sulfuric 2%. Kiềm hóa dịch acid này bằng amoniac đặc đến pH = 10. Sau đó, chiết lại bằng cloroform 5 lần, mỗi lần 10ml. Gộp toàn bộ dịch chiết cloroform, làm khan bằng natri sulfat khan, lọc vào chén cân khô đã cân bì trƣớc. Bay hơi đến cắn, sấy ở 100°C đến khối lƣợng không đổi và đem cân.
c) Sen (lá) Bột dƣợc liệu 2g Thấm ẩm NH3đ Soxhlet Cắn Dịch chiết pH = 10 Dịch chiết pH = 7 Bốc hơi Định lƣợng Etanol 96° PE 3 x 10ml Kiềm hóa NH3đ Dung môi HCl 5% 5 x 5ml CHCl3 5 x 10ml CHCl3 5 x 10ml Nƣớc cất
Hình 3.10 Quy trình định lƣợng alcaloid trong lá Sen
Thuyết minh quy trình
Cân chính xác khoảng 2g bột dƣợc liệu đã sấy khô, thấm ẩm bằng amoniac đậm đặc (TT), để 1 giờ, sau đó cho vào túi làm bằng giấy lọc, đặt vào bình Soxhlet, chiết bằng etanol 96% (TT) cho đến kiệt alcaloid. Cất thu hồi dung môi, hòa tan cắn trong dung dịch acid hydrocloric 5% (TT) 5 lần, mỗi lần 5ml. Lọc, rửa dịch lọc acid
Chương 3 Thực nghiệm
Nguyễn Lê Lịnh 28
bằng ether dầu hỏa (TT) 3 lần, mỗi lần 10ml. Kiềm hóa dịch chiết acid bằng amoniac đậm đặc (TT) đến pH = 10, sau đó lắc với cloroform (TT) 5 lần, mỗi lần 10 ml. Gộp dịch chiết cloroform, rửa dịch cloroform bằng nƣớc cất đến pH trung tính, rồi bốc hơi dung môi tới khô. Hòa tan cắn với một lƣợng chính xác 10 ml acid hydrocloric 0,1N (CĐ). Thêm 5ml nƣớc cất và 2 giọt methyl đỏ (TT). Chuẩn độ dung dịch acid hydrocloric 0,1N (CĐ) thừa bằng dung dịch natri hydroxyd 0,1 N (CĐ).
Hàm lƣợng alcaloid toàn phần (X) trong lá Sen tính bằng phần trăm theo công thức: a 2,95 n) - (10 X%
n: Số ml dung dịch natri hydroxyd 0,1N (CĐ) đã dùng. a: Khối lƣợng bột dƣợc liệu đem định lƣợng đã trừ độ ẩm.
d) Lạc tiên Bột dƣợc liệu 15g Thấm ẩm NH3đ Dịch chiết 100ml Dịch chiết pH = 10 Loại nƣớc Bốc hơi Cân Lọc Kiềm hóa NH3đ H2SO4 10% 4 x 10ml CHCl3 150ml CHCl3 3 x 15ml + 1 x 10ml
Chương 3 Thực nghiệm
Nguyễn Lê Lịnh 29
Thuyết minh quy trình
Cân chính xác 15g bột dƣợc liệu khô kiệt, cho vào bình nón 250ml có nút mài, thấm ẩm đều bằng amoniac đặc (5ml). Thêm vào 150ml cloroform, lắc mạnh, lọc, lấy 100ml dịch lọc tƣơng ứng với 10g bột dƣợc liệu, chiết 4 lần, mỗi lần 10ml H2SO4 10%. Gộp chung các dung dịch acid , kiềm hóa bằng amoniac đặc trong điều kiện lạnh đến pH = 10. Chiết alcaloid bằng cloroform 4 lần, (3 lần đầu tiên mỗi lần 15ml, lần thứ 4 bằng 10ml). Loại nƣớc trong dung dịch cloroform bằng Na2SO4
khan. Cho dịch chiết vào một bình đã cân bì. Bốc hơi dung môi cho đến khô. Cho vào bình hút ẩm với silicagen đến khối lƣợng không đổi, sau đó cân.
Theo Dƣợc điển Việt Nam II quy định dƣợc liệu là lá phải chứa ít nhất 0,7% alcaloid toàn phần.
3.3.2.5 Xác định hàm lượng kim loại nặng
Lấy 2g dƣợc liệu mỗi loại cho vào chén nung; lấy 1ml dung dịch chì mẫu nồng độ 10ppm cho vào 1 cốc khác. Thêm 4ml dung dịch MgSO4 25% trong acid sulfuric 1M (TT) vào mỗi cốc. Trộn đều bằng đủa thủy tinh rồi đun nóng cẩn thận. Đun trên bếp điện cho đến khi cháy thành than. Cho cả 5 cốc vào tủ nung, nung ở nhiệt độ 700°C trong 2 giờ. Thu đƣợc cắn màu xám nhạt. Làm ẩm cắn bằng 0,2ml acid sulfuric 1M, bốc hơi rồi đốt lại. Hòa tan cắn trong 10ml acid HCl 2M, dùng NH3 kiềm hóa đến pH = 7 – 11. Lọc và định mức tới 20ml. Lấy 12ml dung dịch mỗi loại cho vào ống nghiệm, thêm 1,2ml thuốc thử dithizone và lắc mạnh. Để yên 2 phút và so sánh màu với ống mẫu.
Chương 3 Thực nghiệm
Nguyễn Lê Lịnh 30
3.3.3 Quy trình nấu cao các loại dƣợc liệu
Dƣợc liệu Sơ chế Mẫu chiết Bỏ bã, vắt kiệt Nƣớc nóng Bã Cô đặc Loại tạp Cô đặc Bảo quản Etanol Acid Benzoic
Hình 3.12 Quy trình chiết cao bằng phƣơng pháp chiết nóng
Thuyết minh quy trình
Mẫu dƣợc liệu sau khi làm khô đến độ ẩm cần thiết đƣợc cho vào nồi inox, đổ nƣớc vào cho ngập xâm xấp, đậy nắp và đun trên bếp điện. Thời gian trích ly đƣợc tính từ lúc nồi thuốc sôi, theo thực nghiệm thì trong khoảng thời gian từ 20 – 25 phút. Thời gian nấu cao tối ƣu đƣợc khảo sát bằng cách chiết lại bã dƣợc liệu (đã vắt kiệt) sau khi nấu sôi đƣợc 2, 3, 4, 5 giờ, nấu bã dƣợc liệu với lƣợng dung môi khoảng 2/3 so với ban đầu, sau 1 giờ vớt bã, vắt kiệt và định tính với thuốc thử định tính alcaloid (Wagner, Mayer, Dragendorff) thấy tủa ít hoặc không tủa là đƣợc. Sau quá trình khảo sát, chọn thời gian nấu cao tối ƣu là 4 giờ. Dịch chiết lại với bã dƣợc liệu sau khi chiết đƣợc 4 giờ hiện diện rất ít hoạt chất, màu dịch chiết nhạt hơn nhiều so với dịch chiết lần đầu.
Chương 3 Thực nghiệm
Nguyễn Lê Lịnh 31
Dịch chiết sau khi bỏ bã đƣợc lọc trong bằng vải sạch rồi cô đặc đến tỷ trọng cần thiết là 1,05. Trong quá trình này phải giảm nhiệt độ bếp đun, vì nhiệt độ quá cao sẽ làm mất một số hợp chất kém bền nhiệt; cần mở nắp nồi để quá trình bốc hơi nƣớc diễn ra dể dàng hơn. Đến tỷ trọng cần thiết, dịch chiết đƣợc để nguội và cho vào dung dịch etanol 96° với tỷ lệ dịch chiết : etanol = 1 : 1,25 để loại bỏ tạp chất (tỷ lệ này đƣợc khảo sát trên lƣợng tủa tạp loại đƣợc và sự xuất hiên tủa khi cô đặc dịch lọc trong). Hỗn hợp này đƣợc để yên trong từ 2 – 4 giờ rồi đƣợc lọc sạch tủa bằng máy lọc chân không với giấy lọc. Rửa tủa bằng etanol 96°. Dịch lọc sau đó đƣợc cô đặc trên bếp cách thủy với nhiệt độ không quá 80°C đến tỷ trọng 1,2 – 1,3 thì cho thêm acid benzoic tỷ lệ 1/1000 để bảo quản. Cao chiết sau đó đƣợc đậy kín và bảo quản trong tủ lạnh.
3.3.4 Kiểm nghiệm cao dƣợc liệu
3.3.4.1 Định tính
a) Alcaloid
Cân chính xác 0,2g cao hòa tan với 20ml dung dịch acid hydrochloric 1%, lọc, chia dịch lọc thành 4 phần bằng nhau và thử trên 3 loại thuốc thử Wagner, Mayer, Dragendorff; dung dịch sắt (III) clorid áp dụng riêng cho lá Sen.
b) Saponin
Saponin trong cao thuốc cũng đƣợc định tính bằng phƣơng pháp đo cột bọt. Hòa tan 0,2g cao với 100ml nƣớc cất, lọc, điều chỉnh tới 100ml. Tiến hành thí nghiệm giống nhƣ định tính saponin trong dƣợc liệu.
c) Flavonoid
Hòa tan 0,1g cao trong 20ml nƣớc cất, lọc, chia làm 2 phần. Phần 1 làm mẫu đối chứng, phần 2 thêm vài giọt dung dịch 1% NaOH/Etanol. Quan sát sự thay đổi màu sắc dung dịch.
3.3.4.2 Định lượng
Do hoạt chất chính trong sản phẩm siro an thần là alcaloid và sự hiện diện của hoạt chất này với hàm lƣợng cao trong dƣợc liệu nên tôi chỉ định lƣợng alcaloid có trong cao chiết.
Chương 3 Thực nghiệm Nguyễn Lê Lịnh 32 a) Trinh nữ Cao Trinh nữ 1g Bốc hơi tạo cắn CHCl3 5x10ml Làm khan Lọc Bốc hơi Sấy Cân HCl 1% 3 x 10ml Kiềm hóa bằngNH3 đặc
Hình 3.13Quy trình định lƣợng alcaloid trong cao Trinh nữ
Thuyết minh quy trình
Cân chính xác 0,2g cao hòa tan với dung dịch acid hydrochloric 1% (3 lần, mỗi lần 10ml). Lọc dịch acid này vào bình gạn, rửa bông với một ít dung dịch acid hydrocloric 1% Kiềm hóa dịch acid này bằng amoniac đặc đến pH = 10. Sau đó, chiết lại bằng cloroform 5 lần, mỗi lần 10ml. Gộp toàn bộ dịch chiết cloroform, làm khan bằng natri sulfat khan, lọc vào chén cân khô đã cân bì trƣớc. Bay hơi đến cắn, sấy ở 100°C đến khối lƣợng không đổi và đem cân.
Chương 3 Thực nghiệm
Nguyễn Lê Lịnh 33
b) Vông nem
Cao Vông nem 1g Bốc hơi Tạo cắn Chiết CHCl3 5x10ml Làm khan Lọc Bốc hơi