Phôi hợp tử được cô lập giai đoạn trái 12 tháng tuổi. Sử dụng môi trường Y3
với 60 g/l đường bổ sung thêm hàm lượng các chất điều hòa tăng trưởng thực vật tùy theo thành phần và liều lượng. Theo dõi trọng lượng tươi của phôi sau 1 tháng nuôi cấy và khả năng nẩy mầm của phôi sau khi nuôi cấy được 3 và 4 tháng tuổi.
Trọng lượng phôi
Trọng lượng phôi lúc đem nuôi cấy là 0,12 ± 0,07 gam. Sau một tháng nuôi cấy, trọng lượng đạt cao nhất ở môi trường chứa 1mg/l BA và môi trường chứa 1mg/l IAA và 1mg/l BA, trọng lượng thấp ở môi trường đối chứng (môi trường không bổ sung chất điều hòa tăng trưởng thực vật) và môi trường chứa 0,1mg/l IAA và 1mg/l BA. Ở môi trường chứa 1mg/l BA, phôi có biểu hiện nảy chồi và phát triển mạnh về chiều cao. Ở môi trường chứa 1mg/l IAA và 1mg/l BA, phôi phình to thành một khối rắn chắc (bảng 3.15, hình 3.7, ảnh 3.28 - 3.33).
Bảng 3.15: Ảnh hưởng của chất điều hòa tăng trưởng thực vật lên trọng lượng tươi của phôi sau khi nuôi cấy 1 tháng (khi cấy phôi ở giai đoạn trái 12 tháng tuổi, trọng lượng trung bình 0,12 ± 0,07 g).
IAA (mg/l) BA (mg/l) Trọng lượng phôi sau 1 tháng nuôi cấy (g)
0 0 0,68 ± 0,42a 0,1 0 0,77 ± 0,36b 0 0,1 0,73 ± 0,35ab 0 1 0,81 ± 0,56c 0,1 1 0,71 ± 0,36a 1 1 0,83 ± 0,76c
Hình 3.7: Ảnh hưởng của chất điều hòa tăng trưởng thực vật lên trọng lượng phôi sau khi nuôi cấy một tháng.
Ảnh 3.28: Phôi một tháng tuổi ở môi trường đối chứng.
Ảnh 3.29: Phôi một tháng tuổi ở môi trường chứa 0,1 mg/l IAA. 0.68 0.77 0.73 0.81 0.71 0.83 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 Trọng lượng phôi (g)
Ảnh 3.30: Phôi một tháng tuổi ở môi trường chứa 0,1mg/l BA .
Ảnh 3.31: Phôi một tháng tuổi ở môi trường chứa 1mg/l BA.
Ảnh 3.32: Phôi một tháng tuổi ở môi trường chứa 0,1mg/l IAA và 1mg/l BA.
Ảnh 3.33: Phôi một tháng tuổi ở môi trường chứa 1mg/l IAA và 1mg/l BA.
Khả năng nảy mầm của phôi sau 3 và 4 tháng nuôi cấy
Phôi nuôi cấy ở môi trường đối chứng (không bổ sung chất điều hòa tăng trưởng thực vật) có chồi và rễ phát triển nhưng chậm hơn rất nhiều so với môi trường chứa 0,1mg/l IAA (bảng 3.16, hình 3.8, 3.9, ảnh 3.34 - 3.37).
Môi trường chứa 0,1mg/l IAA giúp phôi nẩy mầm tốt nhất. Cây non có chiều cao chồi và chiều dài rễ liên tục tăng sau ba đến bốn tháng nuôi cấy (bảng 3.16, hình 3.8, 3.9, ảnh 3.36, ảnh 3.37).
Môi trường chứa 0,1mg/l BA và môi trường chứa 1mg/l BA có chiều cao chồi phát triển tương đối tốt nhưng rễ không phát triển hoặc phát triển rất kém (bảng 3.16, hình 3.8, 3.9, ảnh 3.38 – 3.41).
Môi trường chứa 0,1 mg/l IAA và 1mg/l BA có chiều cao chồi và chiều dài rễ phát triển tốt, chỉ sau môi trường chứa 0,1 mg/l IAA. Ở môi trường chứa 0,1 mg/l IAA và 1mg/l BA có trọng lượng phôi thấp so với các môi trường khác nhưng khả năng nẩy mầm của phôi tạo cây non khá cao, tốc độ phát triển của chồi và rễ mạnh từ tháng thứ 3 qua tháng thứ 4 (bảng 3.16, hình 3.8, 3.9, ảnh 3.42, ảnh 3.43).
Môi trường chứa 1 mg/l IAA và 1 mg/l BA mặc dù trọng lượng phôi tăng mạnh nhưng phôi không có khả năng nẩy mầm thành cây non, phôi vẫn là một khối cứng, chắc, không phát triển chồi và rễ (bảng 3.16, hình 3.8, 3.9, ảnh 3.44, 3.45).
Bảng 3.16: Ảnh hưởng của chất điều hòa tăng trưởng thực vật lên khả năng nẩy mầm của phôi sau ba và bốn tháng nuôi cấy.
IAA (mg/l)
BA (mg/l)
Cây non 3 tháng tuổi Cây non 4 tháng tuổi Chiều cao chồi
(mm)
Chiều dài rễ (mm)
Chiều cao chồi (mm)
Chiều dài rễ (mm) 0 0 5,67 ± 0,76a 16,00 ± 1,26b 7,82 ± 0,97a 19,67 ± 1,38b 0,1 0 36,05 ± 1,67e 42,67 ± 1,38d 46,00 ± 0,56d 69,00 ± 0,37d 0 0,1 20,01 ± 0,21c - 25,00 ± 1,32b - 0 1 27,33 ± 0,76d 3,33 ± 0,42a 42,33 ± 2,74d 4,00 ± 0,37a 0,1 1 11,67 ± 1,17b 36,67 ± 2,84c 29,01 ± 1,67c 46,00 ± 2,53c 1 1 - - - -
Các số trung bình trong cột với các mẫu tự khác nhau khác biệt có ý nghĩa ở mức p=0,05.
0 10 20 30 40 50 Đối chứng 0,1 IAA 0,1 BA 1 BA 0,1 IAA, 1 BA 1 IAA, 1 BA
Chiều cao chồi
(m
m
)
Hình 3.8: Chiều cao chồi của cây non sau 3 và 4 tháng nuôi cấy ở các môi trường với hàm lượng và thành phần các chất điều hòa
tăng trưởng thực vật khác nhau.
Chất xử lí (mg/l) 3 tháng 4 tháng 0 20 40 60 80 100 Đối chứng 0,1 IAA 0,1 BA 1 BA 0,1 IAA, 1 BA 1 IAA, 1 BA Chiều dài rễ (m m )
Hình 3.9:Chiều dài rễ ở cây non sau 3 và 4 tháng nuôi cấy ở các môi trường với hàm lượng và thành phần các chất điều hòa tăng
trưởng thực vật khác nhau.
Chất xử lí (mg/l)
3 tháng 4 tháng
Ảnh 3.34: Phôi nuôi cấy 3 tháng ở môi trường đối chứng.
Ảnh 3.35:Phôi nuôi cấy 4 tháng ở môi trường đối chứng.
Ảnh 3.36: Phôi nuôi cấy 3 tháng ở môi trường chứa 0,1mg/l IAA.
Ảnh 3.37:Phôi nuôi cấy 4 tháng ở môi trường chứa 0,1mg/l IAA.
Ảnh 3.38: Phôi nuôi cấy 3 tháng ở môi trường chứa 0,1mg/l BA.
Ảnh 3.39:Phôi nuôi cấy 4 tháng ở môi trường chứa 0,1mg/l BA.
Ảnh 3.40: Phôi nuôi cấy 3 tháng ở môi trường chứa 1mg/l BA.
Ảnh 3.41:Phôi nuôi cấy 4 tháng ở môi trường chứa 1mg/l BA.
Ảnh 3.42: Phôi nuôi cấy 3 tháng ở môi trường chứa 0,1mg/l IAA và 1mg/l BA.
Ảnh 3.43:Phôi nuôi cấy 4 tháng ở môi trường chứa 0,1mg/l IAA và 1mg/l BA.
Ảnh 3.44: Phôi nuôi cấy 3 tháng ở môi trường chứa 1mg/l IAA và 1mg/l BA.
Ảnh 3.45:Phôi nuôi cấy 4 tháng ở môi trường chứa 1mg/l IAA và 1mg/l BA.
CHƯƠNG 4: THẢO LUẬN 4.1 Các biến đổi hình thái trong quá trình phát triển phôi
Trái dừa “dâu” phát triển qua từng giai đoạn biểu hiện ở sự biến đổi hình dạng bên ngoài. Khi còn non chưa thụ phấn, hoa (đực và cái) có màu vàng chanh. Khoảng hai tuần sau khi phát hoa thoát khỏi mo, hoa cái bắt đầu thụ phấn với dấu hiệu nhận biết là nuốm hé mở, và có nhiều hạt phấn xung quanh nuốm hoa (ảnh 3.3). Sau khi thụ phấn, trái dừa liên tục tăng kích thước, trọng lượng tươi cùng với sự xuất hiện của phôi nhũ lỏng (nước dừa) và đặc (cơm dừa) (bảng 3.1). Phân tích hoa cái (giai đoạn trái 0 tháng tuổi) và trái dừa (giai đoạn trái 1 và 3 tháng tuổi), phù hợp với kết quả giải phẫu của Chuc và cs. (2006), cho thấy cấu trúc ba lá noãn với ba noãn nhưng chỉ có một noãn phát triển với cuống noãn và nhiều bó mạch.
Nội nhũ lỏng bắt đầu hình thành ở cuối giai đoạn trái ba tháng tuổi và nhanh chóng phát triển đạt thể tích lớn nhất ở giai đoạn trái sáu tháng tuổi, khi phôi đã có thể quan sát được bằng mắt thường. Phôi lớn dần cùng với phôi nhũ đặc dày lên thì thể tích nội nhũ lỏng giảm dần (bảng 3.1), vì phôi nằm trong phôi nhũ đặc và nước dừa cung cấp chất dinh dưỡng cho phôi phát triển (Hoàng Đức Cự 2006).
4.2 Sự thay đổi một số chỉ tiêu sinh hóa và nhu cầu năng lượng trong sự phát triển phôi hợp tử
Hàm lượng đường glucose trong nước dừa cao ở giai đoạn trái 6 và 9 tháng tuổi nhưng giảm ở giai đoạn trái 12 tháng tuổi, trong khi hàm lượng dầu trong cơm dừa tăng ở cả ba giai đoạn này. Như vậy, đường đã được tiêu hóa để sử dụng cho quá trình phát triển phôi mà cơm dừa là nơi trực tiếp chứa phôi. Đường trong nước dừa được phân giải thông qua quá trình hô hấp để cung cấp năng lượng và các tiền chất cho quá trình tổng hợp lipit (Nisch 1953, Nguyễn Như Khanh 2009, Bùi Trang Việt 2000).
Cường độ hô hấp ở khúc cắt chứa phôi liên tục tăng trong giai đoạn trái non (trái 0, 1 và 3 tháng tuổi), vẫn tiếp tục tăng trong giai đoạn trái trưởng thành (trái 6
và 9 tháng tuổi) cho thấy phôi cần nhiều năng lượng để tạo các sơ khởi chồi và rễ. Khi trái chuyển sang giai đoạn khô (trái 12 tháng tuổi), cường độ hô hấp giảm. Theo Nguyễn Như Khanh (2009), kết quả của sự phát triển phôi trong noãn là hạt chín, vỏ noãn mất hầu hết nước và trở thành vỏ hạt bền chắc bao quanh phôi và nội nhũ, phôi ngừng phát triển và hạt rơi vào trạng thái ngủ (cho đến khi nảy mầm).
4.3 Sự thay đổi hoạt tính chất điều hòa tăng trưởng thực vật nội sinh trong quá trình phát triển phôi trình phát triển phôi
Hoạt tính của các chất điều hòa tăng trưởng thực vật nội sinh biến đổi theo thời gian tương ứng với các giai đoạn phát triển phôi. Auxin liên tục tăng trong giai đoạn trái non (trái 0, 1 và 3 tháng tuổi) và trái trưởng thành (trái 6, 9 và 12 tháng tuổi) (bảng 3.6). Cũng chính auxin từ phôi (phôi trong hạt là nguồn auxin nội sinh quan trọng) khuếch tán vào bầu noãn và kích thích sự phát triển của bầu noãn thành quả (Vũ Văn Vụ 1999).
Hoạt tính cytokinin thấp ở giai đoạn trái non (trái 0,1 và 3 tháng tuổi) nhưng lại tăng rất mạnh ở giai đoạn trái trưởng thành (trái 6, 9 và 12 tháng tuổi). So sánh tỉ lệ auxin và cytokinin cho thấy, auxin cao hơn cytokinin ở giai đoạn trái non, nhưng cytokinin cao hơn auxin ở giai đoạn trái trưởng thành. Cytokinin chỉ hoạt động khi auxin hiện diện, không có auxin thì sự phân chia tế bào do cytokinin không xảy ra, và tỉ lệ auxin cao hơn cytokinin kích thích sự xuất hiện và phát triển chồi (Dương Công Kiên 2002, Bùi Trang Việt 2000).
Hoạt tính giberelin khá ổn định trong quá trình phát sinh và phát triển phôi. Giberelin được tổng hợp ở phôi và sự phát triển của các cơ quan là một yếu tố ảnh hưởng đến sự tổng hợp giberelin (Phillips 1971).
Acid abcisic tăng mạnh ở giai đoạn trái 1 tháng tuổi, và giảm dần ở trái 6, 9 và 12 tháng tuổi. Như vậy, khi phôi trưởng thành, acid abcisic giảm để phôi phát triển. Acid abcisic là chất ức chế sinh trưởng tự nhiên, có khả năng làm giảm tác dụng của các chất điều hòa tăng trưởng thực vật khác, nhất là giberelin (Trần Văn Hâu 2009). Acid abcisic cản sự nảy mầm, kéo dài sự ngủ của chồi và hột, làm chậm
sự kéo dài lóng (Bùi Trang Việt 2000). Hoạt tính acid abcisic thấp nhất vào giai đoạn đầu phát sinh phôi, đạt cực đại vào khoảng giữa rồi giảm dần đến mức thấp khi trái trưởng thành (Trần Thế Tục 1998).
4.4 Ảnh hưởng của chất điều hòa tăng trưởng thực vật ngoại sinh lên quá trình phát triển trái và sự rụng trái ngoài thiên nhiên phát triển trái và sự rụng trái ngoài thiên nhiên
Trái dừa ở các buồng dừa được phun các chất điều hòa tăng trưởng thực vật BA, GA3 và nhất là NAA phát triển nhanh hơn so với đối chứng (nước cất), về chiều cao cũng như chu vi trái (bảng 3.9). Hơn nữa, những buồng dừa được phun chất điều hòa tăng trưởng thực vật có tỉ lệ rụng trái non khá thấp (bảng 3.10). Theo Võ Văn Long (2008), hoa cái thụ phấn cho trái, tuy nhiên trái sẽ rụng khi còn non, nhiều nhất trong vòng sáu đến tám tuần sau khi thụ phấn (đôi khi tỉ lệ rụng có thể đến 60 – 70%). Hiện tượng rụng sinh lí này của trái là do hoa cái không thụ phấn, hay có thụ phấn nhưng trái rụng bớt để cây có đủ sức nuôi các trái còn lại (Trần Mỹ Lý và cs. 1990). Do đó, khi tỉ lệ trái rụng giảm thì chiều cao và chu vi trái trên buồng dừa cũng giảm (trái nhỏ lại). Buồng dừa được phun auxin có tỉ lệ rụng trái thấp nhất. Kết quả này phù hợp với quan điểm của Chatterjee và Leopold (1963): auxin hoạt động trực tiếp lên vùng rụng và kiểm soát quá trình rụng.
4.5 Về việc thử nghiệm nuôi cấy in vitro phôi hợp tử dừa “dâu”
Phôi dừa được hình thành trong môi trường vô trùng của trái (phôi nằm trong phần cơm dừa), nên phôi có thể được tách ra và đưa ngay vào môi trường nuôi cấy mà không cần qua bước khử trùng (Vũ Văn Vụ và cs. 2009, Ngô Xuân Bình 2010).
Sự nuôi cấy in vitro phôi ở ba giai đoạn phát triển trái cho thấy phôi ở giai đoạn trái 9 và 12 tháng tuổi phát triển tốt, có tỉ lệ sống sót cao. Phôi ở giai đoạn trái 6 tháng tuổi có kích thước nhỏ, rất khó được cô lập và dễ bị nhiễm khuẩn trong quá trình nuôi cấy, nên tỉ lệ sống sót không cao (bảng 3.11). Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Karun (1994), phôi ở giai đoạn trái 9 và 12 tháng tuổi nảy mầm in
vitronhanh hơn, và khả năng phát triển thành cây non cũng tốt hơn so với ở các giai đoạn khác.
Đối với các môi trường nuôi cấy thử nghiệm, môi trường Y3 với 60 g/l đường phù hợp nhất để nuôi cấy phôi dừa “dâu” (bảng 3.12 – 3.14). Theo Karun (1994), đường tác động đến tỉ lệ phát triển phôi và nảy mầm: nồng độ đường cao thuận lợi cho sự hình thành rễ nhưng kìm hãm sự tạo chồi. Do đó, để phôi nảy mầm và phát triển tốt, rễ và chồi phát triển bình thường, cần nuôi cấy phôi với môi trường Y3 chứa 40 – 60 g/l đường. Môi trường MS giúp phôi phát triển tốt trong giai đoạn đầu, nhưng theo thời gian thì tỉ lệ sống sót của phôi không cao (Assy Bah 1986).
Các chất điều hòa tăng trưởng thực vật được đưa vào môi trường nhằm thúc đẩy sự sinh trưởng và giãn nở của tế bào, tăng cường quá trình sinh tổng hợp và trao đổi chất ở phôi, kích thích sự hình thành rễ và chồi. Cùng môi trường Y3 với 60 g/l đường, sự bổ sung auxin và cytokinin ở liều lượng thích hợp (IAA 0,1mg/l và BA 1mg/l) giúp phôi phát triển mạnh. Nồng độ không phù hợp (môi trường chứa IAA 1mg/l và BA 1mg/l) làm phôi phát triển không bình thường, không phát triển chồi và rễ (Assy Bah vàcs. 1989).
Với môi trường chỉ bổ sung BA 0,1mg/l hay 1mg/l BA, phôi chỉ phát triển chồi mà không phát triển rễ. Môi trường chứa IAA 0,1mg/l là môi trường tốt nhất để nuôi cấy phôi dừa “dâu” (bảng 3.15 - 3.16). Theo Batugal và Engelmann (1998), việc bổ sung IAA ở nồng độ thấp vào môi trường nuôi cấy giúp phát triển hệ thống rễ, nhưng IAA ở nồng độ cao cản sự phát triển của hệ thống chồi.
CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận
Phôi dừa “dâu” nằm trong cơm dừa, ở vị trí “con mắt mềm” và nội nhũ lỏng (nước dừa) là thành phần dinh dưỡng để nuôi phôi.
Hoạt tính của các chất điều hòa tăng trưởng thực vật nội sinh thay đổi theo các giai đoạn phát triển phôi.
Phôi dừa “dâu” ở giai đoạn trái mười hai tháng tuổi phát triển tốt khi nuôi cấy ở môi trường Y3 với 60 g/l đường, 8 g agar và 0,1 mg/l IAA (pH = 5,7 ± 0,2).
Cường độ hô hấp của phôi cao ở giai đoạn phôi đang hình thành và phát triển, sau đó giảm khi phôi trưởng thành.
Auxin ngoại sinh có vai trò làm giảm sự rụng của trái non dừa.
5.2 Đề nghị
Trong tương lai, nếu có điều kiện, chúng tôi sẽ tiếp tục khảo sát ảnh hưởng của các chất điều hòa tăng trưởng thực vật trong sự phát triển phôi dừa “dâu” và trên cơ sở đó, áp dụng các chất điều hòa tăng trưởng thực vật để nuôi cấy phôi ở các giống dừa quý hiếm, có giá trị kinh tế cao như dừa Dứa hay dừa Sáp.
Tài liệu tham khảo
Tiếng Việt
1. Nguyễn Bá (2006), Hình thái học thực vật, Nxb Giáo dục.
2. Ngô Xuân Bình (2010), Nuôi cấy mô tế bào thực vật, Nxb Khoa học và kỹ thuật.
3. Hoàng Đức Cự (2006), Sinh học thực vật, Nxb Đại học Quốc gia Hà Nội. 4. Trần Văn Hâu (2009), Xử lí ra hoa cây ăn trái, Nxb Đại học Quốc gia
TpHCM.
5. Nguyễn Văn Dõng (1962), Đời sống cây dừa và kinh nghiệm trồng dừa miền Nam, Nxb Khoa học.
6. Nguyễn Thị Bích Hồng (2007), Nghiên cứu phát triển vườn dừa thơm hương dứa (Cocos nucifera L.) trên một số vùng đất phù sa đồng bằng song Cửu Long, Luận án tiến sĩ sinh học, Viện sinh học nhiệt đới Tp. HCM.
7. Nguyễn Như Khanh (1996), Sinh lí học sinh trưởng và phát triển thực vật,