Nhằm tìm hiểu vai trò của các chất điều hòa tăng trưởng thực vật nội sinh trong quá trình phát triển phôi ở trái non dừa, khúc cắt cô lập ngay vị trí phôi có cạnh 7 mm, trọng lượng tươi 3 gam được sử dụng trong sinh trắc nghiệm.
Kết quả thu được cho thấy: hoạt tính auxin trong trái dừa tăng mạnh qua ba giai đoạn trái 0, 1 và 3 tháng tuổi. Hoạt tính auxin cũng cao hơn rất nhiều so với ba loại còn lại là acid abcisic, giberelin và cytokinin.
Hoạt tính acid abcisic cao ở giai đoạn trái 1 tháng tuổi (giai đoạn phát triển sớm của phôi) rồi giảm xuống ở giai đoạn trái 3 tháng tuổi.
Hoạt tính giberelin tăng cao nhất giai đoạn trái 3 tháng tuổi. Hoạt tính này không có sự khác biệt ở giai đoạn trái 0 và trái 1 tháng tuổi. Như vậy, ở giai đoạn phát triển sớm của trái, hoạt tính giberelin tăng.
Cytokinin giảm dần qua ba giai đoạn trái từ 0,063 mg/l ở trái 0 tháng tuổi xuống 0,047 mg/l ở giai đoạn trái 3 tháng tuổi (bảng 3.6, hình 3.1).
Bảng 3.6: Hoạt tính chất điều hòa tăng trưởng thực vật nội sinh trong khúc cắt cô lập ngay vị trí phôi ở trái dừa “dâu” giai đoạn trái 0, 1 và 3 tháng tuổi.
Tuổi trái (tháng)
Hoạt tính các chất điều hòa tăng trưởng thực vật (mg/l)
IAA ABA GA3 ZEATIN
0 0,305 ± 0,013a 0,064 ± 0,002a 0,058 ± 0,004a 0,063 ± 0,001c 1 1,169 ± 0,047b 1,034 ± 0,027b 0,053 ± 0,001a 0,051 ± 0,009b 3 1,475 ± 0,021c 0,048 ± 0,001a 0,172 ± 0,007b 0,047 ± 0,001a
3.6.2 Trong nước dừa giai đoạn trái 6, 9 và 12 tháng tuổi
Giai đoạn trái dừa đã trưởng thành, sử dụng nước dừa để đo hoạt tính chất chất điều hòa tăng trưởng thực vật nội sinh nhằm tìm hiểu vai trò của các chất này trong quá trình phát triển phôi.
Auxin tăng dần qua ba giai đoạn trái, tăng mạnh ở giai đoạn trái 12 tháng tuổi.
Ngược lại với auxin, hoạt tính acid abcisic giảm dần qua ba giai đoạn trái, giảm đều.
Giberelin thấp nhất ở giai đoạn trái 9 tháng tuổi . Hoạt tính giberelin không có sự khác biệt giữa hai giai đoạn trái 6 tháng và trái 12 tháng tuổi.
Cytokinin cao nhất ở giai đoạn trái 12 tháng tuổi. Hoạt tính cytokinin không có sự khác biệt giữa hai giai đoạn trái 6 tháng và 9 tháng tuổi (bảng 3.7, hình 3.2).
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 0 tháng 1 tháng 3 tháng Hoạt tính chất điều hòa tăng trư ởng thự c vật (m g/l)
Hình 3.1: Hoạt tính chất điều hòa tăng trưởng thực vật nội sinh trong khúc cắt cô lập ngay vị trí phôi của trái dừa qua ba giai đoạn
0, 1 và 3 tháng tuổi. Tuổi trái IAA ABA GA3 Zeatin
Bảng 3.7: Hoạt tính chất điều hòa tăng trưởng thực vật nội sinh trong nước dừa qua ba giai đoạn trái 6, 9 và 12 tháng tuổi.
Tuổi trái (tháng)
Hoạt tính chất điều hòa tăng trưởng thực vật (x10-2
mg/l)
IAA ABA GA3 ZEATIN
6 0,19 ± 0,05a 1,33 ± 0,01c 0,23 ± 0,02b 1,81 ± 0,03a 9 0,32 ± 0,03b 1,11 ± 0,03b 0,17 ± 0,01a 1,83 ± 0,02a 12 1,06 ± 0,02c 0,73 ± 0,01a 0,23 ± 0,02b 3,08 ± 0,04b
Các số trung bình trong cột với các mẫu tự khác nhau khác biệt có ý nghĩa ở mức p=0,05.
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 6 tháng 9 tháng 12 tháng Hoạt tính chất điều hòa tăng trư ởng thự c vật (x 10 -2 m g/l)
Hình 3.2: Hoạt tính chất điều hòa tăng trưởng thực vật nội sinh trong nước dừa qua ba giai đoạn trái 6, 9 và 12 tháng tuổi.
Tuổi trái IAA ABA GA3 Zeatin
3.7 Khảo sát ảnh hưởng của chất điều hòa tăng trưởng thực vật ngoại sinh lên quá trình phát triển trái dừa “dâu” ngoài thiên nhiên
Trái dừa “dâu” giai đoạn 0 tháng tuổi có chiều cao trung bình 1,63 ± 0,04 cm, chu vi trái là 6,47 ± 0,07 cm.
Trên mỗi buồng dừa, đánh dấu năm trái để theo dõi chiều cao và chu vi trái.
Chiều cao trái
Kết quả cho thấy, ở giai đoạn trái 2 và 4 tuần tuổi, khi phun NAA (2 mg/l) làm tăng chiều cao trái lên rất nhiều so với đối chứng, tiếp đến là những trái được phun GA3 (20 mg/l) và trái được phun BA (10 mg/l) thì chiều cao không có sự khác biệt so với đối chứng (phun nước cất).
Khi trái được 6 - 8 tuần tuổi, chiều cao trái được phun các loại chất điều hòa tăng trưởng thực vật phát triển tương đối đều nhau và cao hơn rất nhiều so với đối chứng (bảng 3.8, hình 3.3).
Bảng 3.8: Chiều cao trái dừa “dâu” được theo dõi qua các giai đoạn sau khi phun chất điều hòa tăng trưởng thực vật.
Chất xử lí Tuổi trái (tuần)
Đối chứng
(nước cất) NAA (2 mg/l) BA (10 mg/l) GA3 (20 mg/l) Chiều cao trái (cm)
2 1,63 ± 0,06a 2,42 ± 0,15c 1,82 ± 0,09ab 2,03 ± 0,12bc 4 2,27 ± 0,07a 2,70 ± 0,21c 2,32 ± 0,09ab 2,72 ± 0,08c 6 2,33 ± 0,08a 3,40 ± 0,18b 3,20 ± 0,17b 3,13 ± 0,14b 8 2,75 ± 0,07a 4,77 ± 0,09c 4,12 ± 0,19b 4,60 ± 0,09c
Chu vi trái
Ở giai đoạn đầu, chu vi trái phát triển không có sự khác biệt so với đối chứng. Khi trái được 8 tuần tuổi thì chu vi ở những trái được phun chất điều hòa tăng trưởng thực vật phát triển vượt mức so với đối chứng. Trái phun NAA (2 mg/l) có chu vi phát triển tốt nhất, không có sự khác biệt giữa trái phun BA (10 mg/l) và trái phun GA3 (20 mg/l) (bảng 3.9, hình 3.4). 0 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4
Chiều cao trái
(cm
)
Hình 3.3: Chiều cao trái dừa "dâu" được theo dõi qua các giai đoạn sau khi phun chất điều hòa tăng trưởng thực vật.
Thời gian (tuần) Đối chứng NAA (2mg/l) BA (10mg/l) GA3 (20mg/l)
Bảng 3.9: Chu vi trái dừa “dâu” được theo dõi qua các giai đoạn sau khi phun chất điều hòa tăng trưởng thực vật.
Chất xử lí Tuổi trái (tuần) Đối chứng (nước cất) NAA (2 mg/l) BA (10 mg/l) GA3 (20 mg/l) Chu vi trái (cm) 2 7,02 ± 0,06a 7,48 ± 0,11c 7,23 ± 0,15ab 6,98 ± 0,08a 4 7,63 ± 0,08b 7,87 ± 0,10b 7,83 ± 0,09b 7,12 ± 0,12a 6 8,05 ± 0,13a 9,83 ± 0,16b 9,73 ± 0,25b 8,70 ± 0,24a 8 8,67 ± 0,17a 11,90 ± 0,24c 10,80 ± 0,38b 10,88 ± 0,32bc
Các số trung bình trong hàng với các mẫu tự khác nhau khác biệt có ý nghĩa ở mức p=0,05.
0 2 4 6 8 10 12 14 1 2 3 4 Chu vi trái (cm )
Hình 3.4: Chu vi trái dừa "dâu" được theo dõi qua các giai đoạn sau khi phun chất điều hòa tăng trưởng thực vật.
Thời gian (tuần) Đối chứng
NAA (2mg/l) BA (10mg/l) GA3 (20mg/l)
Tỉ lệ trái rụng (%)
Kết quả cho thấy, những trái được phun chất điều hòa tăng trưởng thực vật có tỉ lệ trái rụng giảm so với đối chứng. Trong ba loại chất điều hòa tăng trưởng thực vật phun lên buồng dừa thì trái phun GA3 (20mg/l) bị rụng nhiều nhất trong quá trình phát triển, tiếp đến là trái phun BA (10mg/l). Riêng những trái được phun NAA (2mg/l), trái rụng nhiều ở giai đoạn đầu và giảm dần so với đối chứng (bảng 3.10, hình 3.5).
Bảng 3.10: Tỉ lệ rụng của trái dừa “dâu” được theo dõi qua các giai đoạn sau khi phun chất điều hòa tăng trưởng thực vật.
Chất xử lí Tuổi trái (tuần) Đối chứng (nước cất) NAA (2 mg/l) BA (10 mg/l) GA3 (20 mg/l) Tỉ lệ rụng trái (cm) 2 0,00 ± 0,00a 3,18 ± 0,30b 5,28 ± 0,66c 0,00 ± 0,00a 4 21,07 ± 0,55b 8,45 ± 0,79a 7,80 ± 0,98a 27,82 ± 1,29c 6 52,35 ± 0,10d 10,70 ± 1,27a 29,87 ± 2,64b 44,17 ± 2,43c 8 70,83 ± 1,01c 34,77 ± 2,02a 62,30 ± 3,15b 65,55 ± 3,38b
3.8 Thử nghiệm nuôi cấy in vitro phôi hợp tử
3.8.1 Ảnh hưởng của tuổi phôi trong quá trình nuôi cấy phôi in vitro
Phôi dừa “dâu” ở ba giai đoạn trái 6, 9 và 12 tháng tuổiđem nuôi cấy ở môi trường Y3 với 60 g/l đường saccharose, 8 g/l agar, pH 0,57 có bổ sung BA 1 mg/l và IAA 0,1 mg/l. Sự nuôi cấy được tiến hành ở nhiệt độ 27 ± 2 0C, ánh sáng 2500 ± 200 lux (12 giờ mỗi ngày). Tỉ lệ sống sót của phôi được theo dõi sau bốn tuần nuôi cấy.
Kết quả cho thấy, phôi càng trưởng thành khi đem nuôi cấy thì khả năng phát triển càng cao. Như vậy để nuôi cấy đạt tỉ lệ nảy mầm cao thì chọn phôi giai đoạn trái 12 tháng tuổi. Tuy nhiên, trong quá trình nuôi cấy thì thấy phôi giai đoạn trái 9 tháng tuổi có sức sống tốt, ít bị nhiễm trong quá trình cấy, phôi 12 tháng tuổi vẫn có tỉ lệ nhiễm nhưng thấp . Phôi giai đoạn trái 6 tháng tuổi dễ bị nhiễm trong lúc cấy và rất khó lấy phôi để nuôi cấy (bảng 3.11, hình 3.6, ảnh 3.21 – 3.23).
Do đó, phôi 12 tháng tuổi được tiếp tục sử dụng cho các thí nghiệm sau. 0 20 40 60 80 100 1 2 3 4 Tỉ lệ trái dừ a rụng (%)
Hình 3.5: Tỉ lệ rụng của trái dừa "dâu" được theo dõi qua các giai đoạn sau khi phun chất điều hòa tăng trưởng thực vật.
Thời gian (tuần) Đối chứng NAA (2mg/l) BA (10mg/l) GA3 (20mg/l)
Bảng 3.11: Tỉ lệ sống của phôi ở ba giai đoạn trái 6, 9 và 12 tháng tuổi sau 4 tuần nuôi cấy.
Tỉ lệ phôi sống (%)
Tuổi phôi (tháng) Sau 4 tuần nuôi cấy
6 19,6 ± 2,11a
9 75,5 ± 2,37b
12 84,7 ± 3,27c
Hình 3.6: Tỉ lệ sống của phôi ở ba giai đoạn trái 6, 9 và 12 tháng tuổi sau 4 tuần nuôi cấy. 19.6 75.5 84.7 0 20 40 60 80 100 6 tháng 9 tháng 12 tháng Tuổi phôi Tỉ lệ phôi sống (%)
Ảnh 3.21: Phôi dừa “dâu” ở giai đoạn trái 6, 9 và 12 tháng tuổi lúc mới đem cấy ở môi trường Y3.
Ảnh 3.22: Phôi dừa “dâu” ở giai đoạn trái 6, 9 và 12 tháng tuổi sau khi cấy hai tuần ở môi trường Y3.
Ảnh 3.23: Phôi dừa “dâu” ở giai đoạn trái 6, 9 và 12 tháng tuổi sau khi cấy bốn tuần ở môi trường Y3.
3.8.2 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy lên sự phát triển của phôi
Ảnh hưởng lên trọng lượng phôi
Sau một tháng nuôi cấy phôi hợp tử giai đoạn trái 12 tháng tuổi ở ba môi trường khác nhau cho thấy trọng lượng phôi đạt cao nhất ở môi trường Y3 bổ sung 60 g/l đường (0,65g). Trọng lượng thấp nhất ở môi trường MS với 30 g/l đường (0,45g) (bảng 3.12,).
Ở môi trường MS, phôi phát triển rất khỏe trong giai đoạn đầu khi nuôi cấy (1- 3 tuần) nhưng sau đó không thấy phôi phát triển. Môi trường Y3 có phôi phát triển tốt theo thời gian, liên tục tăng kích thước. Môi trường Y3 với 60 g/l đường cho thấy phôi phát triển mạnh hơn môi trường Y3 với 30 g/l đường (ảnh 3.24 - 3.27).
Do đó, môi trường Y3 với 60 g/l đường được tiếp tục sử dụng cho các thí nghiệm tiếp sau.
Bảng 3.12: Trọng lượng phôi giai đoạn trái 12 tháng tuổi sau một tháng nuôi cấy trên ba môi trường khác nhau.
Môi trường Trọng lượng phôi (g) Khi cấy Sau 1 tháng MS với 30 g/l đường
0,11 ± 0,08
0,45 ± 0,04a Y3 với 30 g/l đường 0,61 ± 0,76b Y3 với 60 g/l đường 0,65 ± 0,06c
Ảnh 3.24: Phôi ở giai đoạn trái 12 tháng tuổilúc đem cấy.
Ảnh 3.25: Phôi sau một tháng nuôi cấy ở môi trường MS với 30 g/l đường.
Ảnh 3.26: Phôi sau một tháng nuôi cấy ở môi trường Y3 với 30 g/l đường.
Ảnh 3.27: Phôi sau một tháng nuôi cấy ở môi trường Y3 với 60 g/l đường.
Ảnh hưởng lên khả năng nảy mầm của phôi
Phôi hợp tử có khả năng nẩy mầm cao sau hai tháng nuôi cấy ở môi trường Y3 với 60 g/l đường và môi trường Y3 với 30 g/l đường. Ở môi trường MS với 30 g/l đường, phôi có nẩy mầm nhưng tỉ lệ không cao và theo thời gian thì phôi có biểu hiện suy (bảng 3.13).
Bảng 3.13: Khả năng nảy mầm của phôi ở giai đoạn trái 12 tháng tuổi sau hai tháng nuôi cấy trên ba môi trường nuôi cấy khác nhau.
Môi trường Khả năng nảy mầm (%) Sau 2 tháng MS với 30 g/l đường 26,67 ± 2,11a
Y3 với 30 g/l đường 43,33 ± 2,37b Y3 với 60 g/l đường 50,00 ± 3,65b
Các số trung bình trong cột với các mẫu tự khác nhau khác biệt có ý nghĩa ở mức p=0,05.
Toàn bộ phôi nuôi trong môi trường MS với 30 g/l đường sau bốn tháng đều không phát triển và sau một thời gian thì chết. Ở môi trường Y3 với 30 g/l đường có tỉ lệ sống sót 33,33%. Môi trường Y3 với 60 g/l đường cho thấy phôi tiếp tục phát triển với tỉ lệ 46,67% (bảng 3.14). Từ kết quả cho thấy, môi trường Y3 với 60 g/l đường saccharose là phù hợp nhất để nuôi cấy phôi dừa “dâu” giai đoạn trái 12 tháng tuổi.
Bảng 3.14: Tỉ lệ phôi ở giai đoạn trái 12 tháng tuổi sống và phát triển sau bốn tháng nuôi cấy trên ba môi trường nuôi cấy khác nhau.
Môi trường Số phôi sống và phát triển (%) Sau 4 tháng
MS với 30 g/l đường 0,00 ± 0,00a Y3 với 30 g/l đường 33,33 ± 2,15b Y3 với 60 g/l đường 46,67 ± 2,10c
3.8.3 Ảnh hưởng của chất điều hòa tăng trưởng thực vật trong quá trình phát triển phôi và nảy mầm phát triển phôi và nảy mầm
Phôi hợp tử được cô lập giai đoạn trái 12 tháng tuổi. Sử dụng môi trường Y3
với 60 g/l đường bổ sung thêm hàm lượng các chất điều hòa tăng trưởng thực vật tùy theo thành phần và liều lượng. Theo dõi trọng lượng tươi của phôi sau 1 tháng nuôi cấy và khả năng nẩy mầm của phôi sau khi nuôi cấy được 3 và 4 tháng tuổi.
Trọng lượng phôi
Trọng lượng phôi lúc đem nuôi cấy là 0,12 ± 0,07 gam. Sau một tháng nuôi cấy, trọng lượng đạt cao nhất ở môi trường chứa 1mg/l BA và môi trường chứa 1mg/l IAA và 1mg/l BA, trọng lượng thấp ở môi trường đối chứng (môi trường không bổ sung chất điều hòa tăng trưởng thực vật) và môi trường chứa 0,1mg/l IAA và 1mg/l BA. Ở môi trường chứa 1mg/l BA, phôi có biểu hiện nảy chồi và phát triển mạnh về chiều cao. Ở môi trường chứa 1mg/l IAA và 1mg/l BA, phôi phình to thành một khối rắn chắc (bảng 3.15, hình 3.7, ảnh 3.28 - 3.33).
Bảng 3.15: Ảnh hưởng của chất điều hòa tăng trưởng thực vật lên trọng lượng tươi của phôi sau khi nuôi cấy 1 tháng (khi cấy phôi ở giai đoạn trái 12 tháng tuổi, trọng lượng trung bình 0,12 ± 0,07 g).
IAA (mg/l) BA (mg/l) Trọng lượng phôi sau 1 tháng nuôi cấy (g)
0 0 0,68 ± 0,42a 0,1 0 0,77 ± 0,36b 0 0,1 0,73 ± 0,35ab 0 1 0,81 ± 0,56c 0,1 1 0,71 ± 0,36a 1 1 0,83 ± 0,76c
Hình 3.7: Ảnh hưởng của chất điều hòa tăng trưởng thực vật lên trọng lượng phôi sau khi nuôi cấy một tháng.
Ảnh 3.28: Phôi một tháng tuổi ở môi trường đối chứng.
Ảnh 3.29: Phôi một tháng tuổi ở môi trường chứa 0,1 mg/l IAA. 0.68 0.77 0.73 0.81 0.71 0.83 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 Trọng lượng phôi (g)
Ảnh 3.30: Phôi một tháng tuổi ở môi trường chứa 0,1mg/l BA .
Ảnh 3.31: Phôi một tháng tuổi ở môi trường chứa 1mg/l BA.
Ảnh 3.32: Phôi một tháng tuổi ở môi trường chứa 0,1mg/l IAA và 1mg/l BA.
Ảnh 3.33: Phôi một tháng tuổi ở môi trường chứa 1mg/l IAA và 1mg/l BA.
Khả năng nảy mầm của phôi sau 3 và 4 tháng nuôi cấy
Phôi nuôi cấy ở môi trường đối chứng (không bổ sung chất điều hòa tăng trưởng thực vật) có chồi và rễ phát triển nhưng chậm hơn rất nhiều so với môi trường chứa 0,1mg/l IAA (bảng 3.16, hình 3.8, 3.9, ảnh 3.34 - 3.37).
Môi trường chứa 0,1mg/l IAA giúp phôi nẩy mầm tốt nhất. Cây non có chiều cao chồi và chiều dài rễ liên tục tăng sau ba đến bốn tháng nuôi cấy (bảng 3.16,