Acid abcisic là chất ức chế sinh trưởng rất mạnh nhưng nó không gây hiệu quả độc khi ở nồng độ cao. Vai trò của acid abcisic trong việc điều chỉnh sự rụng đã được phát hiện lần đầu tiên cùng với sự phát hiện ra acid abcisic. Acid abcisic đã kích thích sự xuất hiện và nhanh chóng hình thành tầng rời ở cuống (Ngô Xuân Bình 2010).
Acid abcisic cản tăng trưởng trái và kích thích sự rụng trái non (Nguyễn Như Khanh 1996). Sự tăng trưởng của trái dâu tây ngừng lại trong thời điểm ra hoa là do lá noãn sinh ra chất này. Acid abcisic cản tăng trưởng diệp tiêu Avena do auxin, cản các phản ứng do giberelin kiểm soát nhưng tương tác với cytokinin trong hiệu ứng kích thích sự đậu trái Rosa (Lê Thị Trung 2003; Crane 1969).
Từ lâu, người ta biết rằng, trái và hột đang phát triển là những nguồn giàu các chất điều hòa tăng trưởng thực vật. Nói chung, lúc khởi đầu sự phát triển trái, hàm lượng các chất kích thích tăng trưởng cao và sau đó là hàm lượng các chất cản tăng trưởng, chủ yếu là acid abcisic (Nguyễn Như Khanh 1996). Hàm lượng acid abcisic cao vào cuối giai đoạn phát triển trái và hột liên quan mật thiết với sự chín trái (Bùi Trang Việt 2000; Le Page- Degivry và cs. 1990). Sự giảm hàm lượng nước cũng liên quan tới sự tổng hợp acid abcisic ở những cơ quan khác như lá (Bianco- Trinchant và cs. 1998; Mazliak 1998). Acid abcisic có thể đổi nhanh thành các dạng chuyển hóa như acid phaseic hay acid dihydrophaseic (Nguyễn Như Khanh 1996; Lê Thị Trung 2003). Khi hột đậu trưởng thành (ngày 36), hàm lượng acid abcisic biến mất hoàn toàn do sự chuyển hóa này; điều này giúp hột đậu nẩy mầm nhanh so với hột khó nẩy mầm như hột táo (Hsu 1979).
Vào khoảng cuối 1/3 đầu của sự phát triển hột, sự tăng hàm lượng acid abcisic kích thích giai đoạn trưởng thành của phôi. Phôi tiếp tục phát triển in vitro và hàm lượng acid abcisic giảm khi sự khử nước bắt đầu. Tuy nhiên, sự khử nước cản sự
nẩy mầm và làm ngừng chương trình sinh phôi. Khi có sự thấm nước, với hàm lượng acid abcisic thấp, chương trình nẩy mầm biểu hiện. Acid abcisic cản sự nẩy mầm nhưng kích thích sự tăng trưởng của phôi non và sự tích tụ của các chất dự trữ (Bùi Trang Việt 2000).
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP 2.1 Vật liệu
Cây dừa “dâu” (Cocos nucifera L.) 4 năm tuổi trồng tại vườn nhà số 112 G ấp An Thạnh B – xã Mỹ Thạnh An – TP Bến Tre, được dùng trong các xử lý ngoài đồng (ảnh 2.1).
Trái dừa “dâu” (Cocos nuciferaL.) qua các giai đoạn 0, 1, 3, 6, 9 và 12 tháng tuổi (tương ứng t0, t1, t3, t6, t9 và t12) dùng trong các quan sát hình thái và giải phẫu, xác định hàm lượng hormon nội sinh.
Phôi dừa dâu (Cocos nucifera L.) giai đoạn 6, 9 và 12 tháng tuổi được sử dụng để nuôi cấy in vitro.
Vật liệu sinh trắc nghiệm
Khúc cắt diệp tiêu cây mạ lúa (Oryza sativa L.) 72 giờ tuổi (kể từ khi nảy mầm).
Trụ hạ diệp cây mầm xà lách (Lactuca sativa L.) 18 giờ tuổi (kể từ khi nảy mầm).
Tử diệp cây mầm dưa leo (Cucumis sativus L.) 24 giờ tuổi (kể từ khi nảy mầm).
Ảnh 2.1: Cây dừa “dâu” bốn tuổi trồng tại vườn ở Bến Tre.
2.2 Phương pháp
2.2.1 Quan sát các biến đổi hình thái trong tự nhiên
Trái được theo dõi trong tự nhiên ở 6 giai đoạn phát triển
- Giai đoạn t0: trái không tháng tuổi, được tính từ khi hoa vừa thoát ra khỏi mo, chưa thụ phấn, hoa có màu vàng chanh.
- Giai đoạn t1: trái một tháng tuổi, giai đoạn tất cả hoa cái đã được thụ phấn hoàn toàn. Phần đầu hoa cái bám rất nhiều hạt phấn, nuốm hoa màu trắng mở ra để tiếp nhận hạt phấn. Hoa cái có màu vàng nâu.
- Giai đoạn t3: trái ba tháng tuổi, trái lúc này là một khối cứng, chắc. Nuốm hoa từ màu trắng ở giai đoạn t0 giờ chuyển thành màu đen.
- Giai đoạn t6: trái sáu tháng tuổi, trái dừa phát triển to, màu vàng xanh, vỏ có độ mềm, búng tay nghe âm thanh “tốc, tốc” .
- Giai đoạn t9: trái chín tháng tuổi, trái cứng, chắc, có màu vàng ươm. - Giai đoạn t12: trái mười hai tháng tuổi, trái cứng, khô, có màu vàng nâu.
Sự tăng trưởng trái được theo dõi ở sáu giai đoạn phát triển qua các chỉ tiêu
- Chiều cao trái: dùng thước chữ L, đặt trái ngay vị trí góc vuông của thước, đo chiều cao trái, nơi cao nhất.
- Chu vi trái: dùng thước dây đo vòng chung quanh trái, nơi lớn nhất. - Trọng lượng tươi trái: cân trọng lượng cả trái dừa lúc trái còn tươi.
- Bề dày cơm dừa: dùng thước thẳng đo bề dày cơm, nơi dày nhất lúc trái còn tươi.
- Trọng lượng tươi cơm/trái: nạo phần cơm dừa lúc còn tươi ở mỗi trái và cân bằng cân phân tích.
- Thể tích nước/trái: dùng ống đong để đo thể tích nước ở mỗi trái.
Kết quả thu được là trung bình cộng ba lần lặp lại cho mỗi giai đoạn nghiên cứu. Tiến hành đo hai lần, một lần vào tháng 10/2010 và một lần vào tháng 03/2011.
2.2.2 Quan sát hình thái giải phẫu
Cấu trúc phôi ở các giai đoạn phát triển trái được quan sát dưới kính hiển vi quang học. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Ba giai đoạn đầu (trái 0, 1 và 3 tháng tuổi): mẫu giải phẫu là khúc cắt trái dừa được cô lập ngay vị ví phôi (ảnh 2.2).
Ảnh 2.2: Vị trí cắt ngang và dọc ở trái dừa dâu Cocos nucifera L. với khúc cắt cô lập ngay vị trí phôi (p).
- Ba giai đoạn sau (trái 6, 9 và 12 tháng tuổi): mẫu giải phẫu là phôi dừa giai đoạn 6, 9 và 12 tháng tuổi.
Mẫu được cắt bằng tay trước khi nhuộm với phẩm nhuộm hai màu
Phương pháp giải phẫu lần lượt qua các bước: - Cắt ngang và dọc phôi ở sáu giai đoạn nghiên cứu.
- Tẩy mẫu bằng Javel trong 30 phút, sau đó rửa sạch mẫu nhiều lần bằng nước cất, chậm giấy thấm cho hết nước.
- Ngâm mẫu trong acid acetic 45% trong 5 phút, rửa sạch bằng nước cất.
- Nhuộm mẫu bằng phẩm nhuộm hai màu đỏ carmin-xanh iot trong 15 phút, rửa sạch bằng nước cất.
- Quan sát mẫu dưới kính hiển vi quang học.
Sử dụng máy cắt microtome giải phẫu phôi
Phôi ở ba giai đoạn trái 6, 9 và 12 tháng tuổi được cắt dọc bằng microtome qua các bước:
1. Cố định mẫu
Phôi dừa sau khi lấy ra từ trái được cố định ngay trong môi trường FAA (formadehid acol acid) (phụ lục 2.1). Sau 24 giờ, chuyển mẫu vào etanol 700.
2. Đúc mẫu
Loại nước bằng cách đặt mẫu lần lượt trong: - Etanol 700: 3 lần, mỗi lần 20 phút.
- Etanol 950: 3 lần, mỗi lần 20 phút. - Etanol 1000: 3 lần, mỗi lần 20 phút.
Loại etanol bằng cách đặt mẫu lần lượt trong: - Butanol 1: 30 phút.
- Butanol 2: 30 phút. - Butanol 3: 60 phút.
- Butanol 4: 10 giờ hoặc qua đêm.
Loại butanol bằng cách đặt mẫu lần lượt trong paraffin tan ở 560 – 600C: - Paraffin 1: 1 giờ.
- Paraffin 2: 1 giờ. - Paraffin 3: 1 giờ.
Đổ paraffin nóng chảy vào khuôn, đặt mẫu vào và đổ đầy paraffin. 3. Cắt và dán mẫu
Mẫu được cắt dọc thành từng lát mỏng 5μm nhờ máy vi phẫu (microtome). Băng paraffin có chứa mẫu được cắt thành từng đoạn ngắn và được dán lên lam chứa dung dịch gelatin 1%. Đặt mẫu trên bếp ở nhiệt độ khoảng 350
C. Mẫu dãn ra dán chặt vào lam. Giữ mẫu trong tủ ấm ở 300C trong hai ngày để cho mẫu thật khô.
4. Nhuộm mẫu
Loại paraffin bằng cách đặt mẫu lần lượt trong: - Méthylcyclohexan 1: 10 phút.
- Méthylcyclohexan 2: 10 phút.
Rửa mẫu bằng etanol 1000. Sau đó, đặt mẫu lần lượt trong: - Etanol 1000: 5 phút.
- Etanol 950: 5 phút. - Etanol 700: 5 phút. - Nước cất: 5 phút.
Nhuộm mẫu bằng phẩm nhuộm hai màu đỏ carmin-xanh iot và quan sát dưới kính hiển vi quang học. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
2.2.3 Định lượng đường glucose bằng phương pháp quang phổ hấp thụ
Lập đường chuẩn glucose
Pha glucose theo các nồng độ 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 mg/l. Cho dung dịch glucose phản ứng màu với phenol 5% và acid sulfuric đậm đặc theo tỉ lệ glucose: phenol 5%: acid sulfuric đậm đặc (1:1:5 theo thể tích). Đo mật độ quang (OD) bằng máy quang phổ ở bước sóng 490nm với chuẩn là nước cất: phenol 5%: acid sulfuric đậm đặc (1:1:5 theo thể tích). Thu các giá trị đo được và vẽ đường chuẩn của glucose theo tám nồng độ khác nhau.
Li trích mẫu và đo
Li trích và đo hàm lượng đường trong nước dừa ở ba giai đoạn trái 6, 9 và 12 tháng tuổi.
Đong 1ml nước dừa với 10ml cồn 960, đun sôi cách thủy cho cô cạn dung dịch rồi pha loãng với 1000ml nước cất. Dịch trích đường thu được cho thực hiện phản ứng màu với phenol 5% và acid sulfuric đậm đặc theo tỉ lệ 1:1:5 thể tích. Đo mật độ quang ở bước sóng 490nm. Tính hàm lượng đường dựa theo đường chuẩn glucose (Coombs và cs 1987).
Mỗi giai đoạn lấy nước dừa của ba trái trộn lại. Thực hiện đo hàm lượng glucose ba lần cho mỗi giai đoạn. Kết quả là trung bình cộng của ba lần lặp lại với sai số chuẩn.
2.2.4 Định lượng dầu bằng phương pháp cổ truyền
Định lượng dầu trong cơm dừa ở ba giai đoạn trái 6, 9 và 12 tháng tuổi. Cho tất cả cơm dừa vào cối đá giã nhỏ (đối với trái giai đoạn trái 6 và 9 tháng tuổi vì cơm dừa ở giai đoạn này rất mềm) và dùng bàn nạo để nạo dừa (đối với trái giai đoạn trái 12 tháng tuổi vì cơm dừa lúc này cứng). Sau đó trộn cơm dừa đã nạo vào nước ấm rồi vắt lấy nước. Thực hiện nhiều lần để đảm bảo lấy gần hết lượng dầu chứa trong cơm dừa. Nước cốt thu được đem cô cạn trên lửa nhỏ sẽ thu được dầu.
Mỗi giai đoạn lấy cơm dừa của ba trái trộn lại, mỗi lần xử lí 100g trọng lượng tươi. Kết quả là trung bình cộng của ba lần lặp lại với sai số chuẩn.
2.2.5 Đo cường độ hô hấp
Khúc cắt ngay vị trí phôi ở trái dừa giai đoạn trái 0, 1 và 3 tháng tuổi (khúc cắt chứa phôi có cạnh 7mm, trọng lượng tươi 1 gam) (ảnh 2.4), phôi dừa ở giai đoạn trái 6, 9 và 12 tháng tuổi (lấy cả phôi đem cân cho đủ 1 gam) (ảnh 2.5). Đo cường độ hô hấp của mẫu (µl oxygen hấp thu /gam TLT /giờ ) được xác định bằng máy Warburg ở 25o
C, trong tối. Kết quả là giá trị trung bình của ba lần lặp lại.
Cân chính xác trọng lượng tươi mẫu vật. Rửa sạch mẫu nhẹ nhàng và đựng trong nước cất. Cho vào thân bình Warburg 2ml nước cất. Dùng kẹp cho mẫu vật vào thân bình. Cho vào trụ giữa 0,5ml dung dịch KOH 20%. Dùng kẹp cho mảnh
giấy lọc đã xếp vào trụ giữa. Thực hiện một bình nhiệt khí áp kế với 2,5ml nước cất (không có mẫu vật). Thoa vaselin vào mặt trong cổ bình (kể cả ống nhánh). Gắn bình Warburg vào áp kế, xoay nhẹ nút và bình để chỗ ráp thật kín. Buộc thun qua các móc để giữ bình không rớt.
Gắn áp kế vào thành máy Warburg, thân bình ngập trong nước. Mở khóa chia ba để áp kế thông với khí quyển.
Cho máy lắc 10 phút (thời gian này cho nhiệt độ khí trong bình ổn định với nhiệt độ nước là 250
C).
Sau 10 phút, tắt máy lắc. Điều chỉnh mực chất lỏng trong áp kế đến vạch 10. Đóng khóa áp kế để hệ thống bình Warburg và nhánh áp kế kín. Mở máy lắc, ghi thời điểm t1: thí nghiệm đo bắt đầu.
Khi muốn đọc số đo (sau mỗi 15 phút): ngừng máy lắc, điều chỉnh chất lỏng trong nhánh kín của áp kế về vạch 10. Đọc mực chất lỏng bên nhánh mở của áp kế. Tính trị số ΔP bằng số mm chất lỏng chênh lệch giữa hai nhánh áp kế. Tính trị số Δv ở bình (thể tích khí oxy bị mô hấp thu) qua hệ thức Δv = K. ΔP, từ đó tính ra cường độ hô hấp của mô thí nghiệm (µl oxygen hấp thu/gam TLT /giờ).
Ảnh 2.4: Trái dừa “dâu” giai đoạn trái 0, 1 và 3 tháng tuổi (đã bóc bỏ cánh) với khúc cắt cô lập ngay vị trí phôi.
Ảnh 2.5: Trái dừa “dâu” giai đoạn trái 6, 9 và 12 tháng tuổi (đã bóc bỏ vỏ) cho thấy vị trí phôi nằm ở “con mắt mềm” trong 3 mắt dừa.
2.2.6 Đo hoạt tính các chất điều hòa tăng trưởng thực vật Li trích và phân đoạn Li trích và phân đoạn
Các chất điều hòa tăng trưởng thực vật nội sinh được li trích và phân đoạn theo Bùi Trang Việt (1992), Meidner (1984) và Yokota và cs. (1980).
Vì ba giai đoạn đầu (trái 0, 1 và 3 tháng tuổi) trái dừa còn non, chưa có nước dừa nên sử dụng khúc cắt cô lập ngay vị trí phôi với trọng lượng tươi là 3 gam để đo hoạt tính chất điều hòa tăng trưởng thực vật. Ba giai đoạn sau (trái 6, 9 và 12 tháng tuổi) đã có nước dừa và vì nước dừa là thành phần quan trọng để nuôi phôi phát triển nên sử dụng nước dừa ở ba giai đoạn sau để tiến hành sinh trắc nghiệm xác định hoạt tính chất điều hòa tăng trưởng thực vật. Vì thành phần chất điều hòa tăng trưởng thực vật trong nước khá thấp nên sử dụng 50 ml nước dừa đem quạt cạn rồi mới tiến hành li trích.
Nghiền 3 gam thịt trái chứa phôi (đối với trái non dừa giai đoạn trái 0, 1 và 3 tháng tuổi) hay 50 ml nước dừa (đối với trái dừa giai đoạn trái 6, 9 và 12 tháng tuổi) trong 50ml methanol 80%, để trong tối, thỉnh thoảng lắc. Sau 24 giờ, lọc hỗn hợp và
thu lấy dịch lọc I. Thêm vào bã 20ml methanol 80%, lắc 20 phút, lọc thu dịch lọc II. Lặp lại như trên một lần nữa và thu dịch lọc III. Hòa chumg 3 dịch lọc I, II, III, đem cô cạn dưới quạt còn khoảng 1ml.
Thêm nước cất vào cho đủ 10ml, dịch nước được chỉnh pH 2,5 với dung dịch HCl 1%. Cho hỗn hợp vào bình lóng, thêm 15ml eter, lắc bình lóng khoảng 20 phút, để yên và chờ dịch lọc trong bình lóng phân lớp. Tách lấy dịch nước (lớp dưới) vào một becher và dịch eter (lớp trên) vào một becher khác. Từ dịch nước thu được, lặp lại sự lóng tương tự hai lần nữa. Sau quá trình này, thu được dịch eter 1 (chuẩn bị cho sự sắc ký và sinh trắc nghiệm nhóm chất acid: IAA, ABA và GA3) và dịch nước.
Dịch nước này được chỉnh pH 7 và tiếp tục lóng eter theo cách tương tự như trên, sau đó thu dịch eter 2 (dịch để sắc ký và sinh trắc nghiệm zeatin) và nước (bỏ).
Dịch eter 1 và 2 thu từ những lần lóng được cho vào bình lóng (riêng cho từng phần) thêm 3ml dung dịch NaHCO3 8%, lắc khoảng 5 phút, để yên hỗn hợp trong bình lóng sẽ phân thành hai lớp, loại bỏ lớp bên dưới. Tiếp tục lặp lai như vậy một lần nữa với 3ml NaHCO3 8%. Mỗi dịch eter thu được từ quá trình này được cho vào một becher và quạt cạn đến 0,5ml. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Sắc ký lớp mỏng
Dịch acid và trung tính (trong eter) của thịt trái chứa phôi và nước dừa được chấm trên bản mỏng silicagel 60 F254 (mã số 1.05554, Merck), ở nhiệt độ 30oC. Dung môi di chuyển là chloroform : metanol : acid acetic (tỉ lệ 80 : 15 : 5 theo thể tích). Vị trí hormon tăng trưởng thực vật trên bản sắc ký được phát hiện nhờ quan sát dưới tia UV ở bước sóng 254 nm (Yokota và cs. 1980).
Xác định hoạt tính các chất điều hòa tăng trưởng thực vật bằng các sinh trắc nghiệm
Các chất điều hòa tăng trưởng thực vật được trích từ trái (giai đoạn trái 0, 1 và 3 tháng tuổi) và nước dừa (giai đoạn trái 6, 9 và 12 tháng tuổi) được xác định tương ứng với các băng trên bản silicagel nhờ giá trị Rf của mỗi chất chuẩn. Chất điều hòa tăng trưởng thực vật nội sinh được cô lập riêng, cạo lấy các hạt silicagel
trên bản sắc ký, ngâm với nước cất 24 giờ để chuẩn bị sinh trắc nghiệm xác định hoạt tính.
Sinh trắc nghiệm auxin và acid abscisic
Hoạt tính auxin và acid abcisic được xác định nhờ sinh trắc nghiệm diệp tiêu lúa (Bùi Trang Việt 1992). Hột lúa được cho nẩy mầm trong tối. Sau 80 giờ, diệp tiêu (chưa bị xé) được cắt thành đoạn dài 2mm để dùng trong sinh trắc nghiệm. Mỗi nghiệm thức gồm 10 khúc cắt diệp tiêu. Sự gia tăng chiều dài của diệp tiêu được đo sau 24 giờ, trong tối, nhiệt độ 30 ± 1o
C. Hoạt tính của auxin và acid abcisic lần lượt tỉ lệ thuận và nghịch với sự sai biệt chiều dài diệp tiêu so với đối chứng và được tính bằng cách so sánh sai biệt chiều dài của diệp tiêu trong các dịch trích và các