Li trích và phân đoạn
Các chất điều hòa tăng trưởng thực vật nội sinh được li trích và phân đoạn theo Bùi Trang Việt (1992), Meidner (1984) và Yokota và cs. (1980).
Vì ba giai đoạn đầu (trái 0, 1 và 3 tháng tuổi) trái dừa còn non, chưa có nước dừa nên sử dụng khúc cắt cô lập ngay vị trí phôi với trọng lượng tươi là 3 gam để đo hoạt tính chất điều hòa tăng trưởng thực vật. Ba giai đoạn sau (trái 6, 9 và 12 tháng tuổi) đã có nước dừa và vì nước dừa là thành phần quan trọng để nuôi phôi phát triển nên sử dụng nước dừa ở ba giai đoạn sau để tiến hành sinh trắc nghiệm xác định hoạt tính chất điều hòa tăng trưởng thực vật. Vì thành phần chất điều hòa tăng trưởng thực vật trong nước khá thấp nên sử dụng 50 ml nước dừa đem quạt cạn rồi mới tiến hành li trích.
Nghiền 3 gam thịt trái chứa phôi (đối với trái non dừa giai đoạn trái 0, 1 và 3 tháng tuổi) hay 50 ml nước dừa (đối với trái dừa giai đoạn trái 6, 9 và 12 tháng tuổi) trong 50ml methanol 80%, để trong tối, thỉnh thoảng lắc. Sau 24 giờ, lọc hỗn hợp và
thu lấy dịch lọc I. Thêm vào bã 20ml methanol 80%, lắc 20 phút, lọc thu dịch lọc II. Lặp lại như trên một lần nữa và thu dịch lọc III. Hòa chumg 3 dịch lọc I, II, III, đem cô cạn dưới quạt còn khoảng 1ml.
Thêm nước cất vào cho đủ 10ml, dịch nước được chỉnh pH 2,5 với dung dịch HCl 1%. Cho hỗn hợp vào bình lóng, thêm 15ml eter, lắc bình lóng khoảng 20 phút, để yên và chờ dịch lọc trong bình lóng phân lớp. Tách lấy dịch nước (lớp dưới) vào một becher và dịch eter (lớp trên) vào một becher khác. Từ dịch nước thu được, lặp lại sự lóng tương tự hai lần nữa. Sau quá trình này, thu được dịch eter 1 (chuẩn bị cho sự sắc ký và sinh trắc nghiệm nhóm chất acid: IAA, ABA và GA3) và dịch nước.
Dịch nước này được chỉnh pH 7 và tiếp tục lóng eter theo cách tương tự như trên, sau đó thu dịch eter 2 (dịch để sắc ký và sinh trắc nghiệm zeatin) và nước (bỏ).
Dịch eter 1 và 2 thu từ những lần lóng được cho vào bình lóng (riêng cho từng phần) thêm 3ml dung dịch NaHCO3 8%, lắc khoảng 5 phút, để yên hỗn hợp trong bình lóng sẽ phân thành hai lớp, loại bỏ lớp bên dưới. Tiếp tục lặp lai như vậy một lần nữa với 3ml NaHCO3 8%. Mỗi dịch eter thu được từ quá trình này được cho vào một becher và quạt cạn đến 0,5ml.
Sắc ký lớp mỏng
Dịch acid và trung tính (trong eter) của thịt trái chứa phôi và nước dừa được chấm trên bản mỏng silicagel 60 F254 (mã số 1.05554, Merck), ở nhiệt độ 30oC. Dung môi di chuyển là chloroform : metanol : acid acetic (tỉ lệ 80 : 15 : 5 theo thể tích). Vị trí hormon tăng trưởng thực vật trên bản sắc ký được phát hiện nhờ quan sát dưới tia UV ở bước sóng 254 nm (Yokota và cs. 1980).
Xác định hoạt tính các chất điều hòa tăng trưởng thực vật bằng các sinh trắc nghiệm
Các chất điều hòa tăng trưởng thực vật được trích từ trái (giai đoạn trái 0, 1 và 3 tháng tuổi) và nước dừa (giai đoạn trái 6, 9 và 12 tháng tuổi) được xác định tương ứng với các băng trên bản silicagel nhờ giá trị Rf của mỗi chất chuẩn. Chất điều hòa tăng trưởng thực vật nội sinh được cô lập riêng, cạo lấy các hạt silicagel
trên bản sắc ký, ngâm với nước cất 24 giờ để chuẩn bị sinh trắc nghiệm xác định hoạt tính.
Sinh trắc nghiệm auxin và acid abscisic
Hoạt tính auxin và acid abcisic được xác định nhờ sinh trắc nghiệm diệp tiêu lúa (Bùi Trang Việt 1992). Hột lúa được cho nẩy mầm trong tối. Sau 80 giờ, diệp tiêu (chưa bị xé) được cắt thành đoạn dài 2mm để dùng trong sinh trắc nghiệm. Mỗi nghiệm thức gồm 10 khúc cắt diệp tiêu. Sự gia tăng chiều dài của diệp tiêu được đo sau 24 giờ, trong tối, nhiệt độ 30 ± 1o
C. Hoạt tính của auxin và acid abcisic lần lượt tỉ lệ thuận và nghịch với sự sai biệt chiều dài diệp tiêu so với đối chứng và được tính bằng cách so sánh sai biệt chiều dài của diệp tiêu trong các dịch trích và các dung dịch IAA 1 mg/l và ABA 1 mg/l.
Sinh trắc nghiệm cytokinin
Hoạt tính cytokinin được đo bằng sinh trắc nghiệm tử diệp dưa leo. Hột dưa leo được ngâm 2 giờ, cho nảy mầm sau 24 giờ và khi rễ mầm nhú ra khoảng 2 mm thì tử diệp được cắt ra để dùng trong sinh trắc nghiệm. Mỗi nghiệm thức gồm 5 tử diệp. Hoạt tính cytokinin tỉ lệ thuận với sai biệt trọng lượng tươi của tử diệp so với đối chứng và được tính bằng cách so sánh với dung dịch zeatin 1 mg/l sau 48 giờ chiếu sáng (2000 ± 200 lux), ở nhiệt độ 30 ± 1oC, ẩm độ 65 ± 5%.
Sinh trắc nghiệm giberelin
Hoạt tính giberelin được đo bằng sinh trắc nghiệm trụ hạ diệp cây mầm xà lách sau 24 giờ cho nảy mầm ở 2000 ± 200 lux, nhiệt độ 30 ± 1oC, ẩm độ 65 ± 5%. Các hột với rễ mầm nhú ra 1mm được chọn để dùng trong sinh trắc nghiệm. Mỗi nghiệm thức gồm 10 cây mầm. Hoạt tính giberelin tỉ lệ thuận với sự sai biệt chiều dài trụ hạ diệp so với đối chứng sau 72 giờ xử lý và được tính bằng cách so sánh với dung dịch GA3 10 mg/l.
Sự ly trích, phân đoạn và sinh trắc nghiệm các chất điều hòa tăng trưởng thực vật được thực hiện trong ba lần riêng biệt. Hoạt tính chất điều hòa tăng trưởng thực vật là giá trị trung bình của ba lần lặp lại.
2.2.7 Khảo sát ảnh hưởng của chất điều hòa tăng trưởng thực vật ngoại sinh lên sự phát triển trái dừa “dâu” ngoài thiên nhiên