Cấu trúc phôi ở các giai đoạn phát triển trái được quan sát dưới kính hiển vi quang học.
- Ba giai đoạn đầu (trái 0, 1 và 3 tháng tuổi): mẫu giải phẫu là khúc cắt trái dừa được cô lập ngay vị ví phôi (ảnh 2.2).
Ảnh 2.2: Vị trí cắt ngang và dọc ở trái dừa dâu Cocos nucifera L. với khúc cắt cô lập ngay vị trí phôi (p).
- Ba giai đoạn sau (trái 6, 9 và 12 tháng tuổi): mẫu giải phẫu là phôi dừa giai đoạn 6, 9 và 12 tháng tuổi.
Mẫu được cắt bằng tay trước khi nhuộm với phẩm nhuộm hai màu
Phương pháp giải phẫu lần lượt qua các bước: - Cắt ngang và dọc phôi ở sáu giai đoạn nghiên cứu.
- Tẩy mẫu bằng Javel trong 30 phút, sau đó rửa sạch mẫu nhiều lần bằng nước cất, chậm giấy thấm cho hết nước.
- Ngâm mẫu trong acid acetic 45% trong 5 phút, rửa sạch bằng nước cất.
- Nhuộm mẫu bằng phẩm nhuộm hai màu đỏ carmin-xanh iot trong 15 phút, rửa sạch bằng nước cất.
- Quan sát mẫu dưới kính hiển vi quang học.
Sử dụng máy cắt microtome giải phẫu phôi
Phôi ở ba giai đoạn trái 6, 9 và 12 tháng tuổi được cắt dọc bằng microtome qua các bước:
1. Cố định mẫu
Phôi dừa sau khi lấy ra từ trái được cố định ngay trong môi trường FAA (formadehid acol acid) (phụ lục 2.1). Sau 24 giờ, chuyển mẫu vào etanol 700.
2. Đúc mẫu
Loại nước bằng cách đặt mẫu lần lượt trong: - Etanol 700: 3 lần, mỗi lần 20 phút.
- Etanol 950: 3 lần, mỗi lần 20 phút. - Etanol 1000: 3 lần, mỗi lần 20 phút.
Loại etanol bằng cách đặt mẫu lần lượt trong: - Butanol 1: 30 phút.
- Butanol 2: 30 phút. - Butanol 3: 60 phút.
- Butanol 4: 10 giờ hoặc qua đêm.
Loại butanol bằng cách đặt mẫu lần lượt trong paraffin tan ở 560 – 600C: - Paraffin 1: 1 giờ.
- Paraffin 2: 1 giờ. - Paraffin 3: 1 giờ.
Đổ paraffin nóng chảy vào khuôn, đặt mẫu vào và đổ đầy paraffin. 3. Cắt và dán mẫu
Mẫu được cắt dọc thành từng lát mỏng 5μm nhờ máy vi phẫu (microtome). Băng paraffin có chứa mẫu được cắt thành từng đoạn ngắn và được dán lên lam chứa dung dịch gelatin 1%. Đặt mẫu trên bếp ở nhiệt độ khoảng 350
C. Mẫu dãn ra dán chặt vào lam. Giữ mẫu trong tủ ấm ở 300C trong hai ngày để cho mẫu thật khô.
4. Nhuộm mẫu
Loại paraffin bằng cách đặt mẫu lần lượt trong: - Méthylcyclohexan 1: 10 phút.
- Méthylcyclohexan 2: 10 phút.
Rửa mẫu bằng etanol 1000. Sau đó, đặt mẫu lần lượt trong: - Etanol 1000: 5 phút.
- Etanol 950: 5 phút. - Etanol 700: 5 phút. - Nước cất: 5 phút.
Nhuộm mẫu bằng phẩm nhuộm hai màu đỏ carmin-xanh iot và quan sát dưới kính hiển vi quang học. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});