Lấy mẫu, bảo quản và phõn tớch theo TCVN 4833 (1993), FAO(1992).
Cỏ rụ phi ủược bỏ võy, vụ trựng bề mặt da bằng cỏch tẩm cồn 96o, rửa lại bằng nước cất vụ trựng, bỏ xương lấy thịt cõn ủịnh lượng mẫu nghiờn cứu.
1
2
3 4
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ………45
* Xỏc ủịnh chỉ tiờu E.coli trong 1g thịt trờn mụi trường Macconkey agar:
ðồng nhất và pha loóng mẫu: Cõn 10g thịt tươi nghiền nỏt trong cối sứ, nghiền tiếp bằng mỏy xay thịt, cho vào bỡnh tam giỏc 500, bổ sung 90ml dịch dinh dưỡng Nutrient broth (hoặc BPW), ủược ủộ pha loóng 10-1. Tiếp tục pha loóng ủến ủậm ủộ
khụng cũn khả năng dương tớnh (106, 107).
- Cấy dàn trờn thạch Macconkey, mỗi ủộ pha loóng cấy trờn 2 ủĩa thạch khỏc nhau, bồi dưỡng 37oC/24h.
- ðếm số khuẩn lạc nghi E.coli (dạng S, bề mặt vồng, rỡa gọn, trũn, màu ủỏ, cỏnh sen, xung quanh cú vựng mờ sương). Chỉ những dia thạch sau khi cấy 37oC/24h (với 0, lml dịch nuụi cấy) cú ớt nhất 30 khuẩn lạc và khụng quỏ 300 mới
ủược chấp nhận. Tớnh kết quả theo Quinn.P ột al (1994) [69].
- Trờn mỗi ủĩa thạch, chọn ớt nhất 5 khuẩn lạc ủồng nhất nghi E.coli ủem giỏm
ủịnh ủặc tớnh sinh vật hoỏ học: Kiểm tra hỡnh thỏi, kớch thước (0,3 - 0,6 x 2- 03àm), tớnh chất bắt màu gr (-),phản ứng sinh Indol 45pC(+), H2S, urease (-),
MR dương tớnh, VP(-), Citrat(-). Giỏm ủịnh serotype khỏng nguyờn O. Xỏc
ủịnh khả năng sản sinh ủộc tố, ủộc lực.. .
* Phương phỏp phỏt hiện, xỏc ủịnh Salmonella trong 25g thịt trờn mụi trường Nutrient broth, Selenite brotb, RVvà XLD agar.
- Salmonella choleraesuis
- Salmonella typhi
- Salmonella typhimurium
- Salmonella enteritidis
Trong tổng số hơn 2000 loài khỏc nhau, chỉ cú một số ớt gõy bệnh cho người và vật nuụi. TCVS khụng cho phộp cú mặt Salmonella trong tất cả cỏc loại thực phẩm.
Bước 1 - Chuẩn bị và ủồng nhất mẫu:
Cõn 25g thịt cỏ, nghiền nhuyễn, cho vào bỡnh tam giỏc 500, bổ sung 225ml dịch dinh dưỡng Nutrient broth, ủược nồng ủộ 10 -1. ðể tủấm 37oC/16-24h.
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ………46
Bước 2 - Tăng sinh mẫu ủó ủồng nhất:
Dựng pipet vụ trựng hỳt 1ml mẫu ủó ủồng nhất theo bước 1, cấy vào l0ml mụi trường Selenite broth, RV bồi dưỡng 43oC/24h (ở nhiệt ủộ này Proteus sp và nhiều vi khuẩn tạp nhiễm từ phõn bịức chế khụng phỏt triển).
Cấy trực tiếp canh khuẩn Selenite broth, RV 24h vào mụi trường XLD agar, bồi dưỡng 37oC/24h. ðọc kết quả.
- Salmonella phỏt triển mạnh, khụng lờn men lactoz, khuẩn lạc dạng S, màu
ủỏ, giữa cú chấm ủen, trũn (do sản sinh H2S).
- E.coli phỏt triển yếu, khuẩn lạc dạng S, màu vàng nhạt tạo một vựng sỏng ở (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
xung quanh khuẩn lạc (do lờn men lactose, sinh hơi).
Bước 3 - Giỏm ủịnh ủặc tớnh sinh hoỏ:
Chọn khuẩn lạc nghi Salmonella, nhuộm Gram kiểm tra hỡnh thỏi, kớch thước 0,4-0,6 x l-3àm, khụng cú giỏp mụ, khụng sản sinh nha bào, di ủộng ủược do cú lụng, từ 7-12lụng (trừ Salmonella puliorum và Salmonella gallinarum), bắt màu giam õm.
Giỏm ủịnh ủặc tớnh lờn men ủường glucose (+), lactose (-), H2S (+), Indol 37oC (-), urease (-), Citrat (+). Giỏm ủịnh serotype khỏng huyết thanh 0, H (khỏng nguyờn lụng H).
Xỏc ủịnh khả năng sản sinh ủộc tố, ủộc lực của chủng vi khuẩn Salmonella
phõn lập ủược.
* Phương phỏp phỏt hiện, xỏc ủịnh Aeromonas spp trong 1 gam thịt cỏ rụ phi
Trộn 10g mẫu trong 90 ml TSBA trong thời gian khoảng 2 phỳt sau ủú ủem nuụi cấy ở nhiệt ủộ 28oC trong khoảng thời gian từ 18 - 24h.
Sau khi nuụi cấy chuẩn bị dóy ống pha loóng của mụi trường tăng sinh trong BPD. Chuyển 0,1 ml của dóy nụng ủộ pha loóng từ 10-4 - 10-6 lờn trờn bề mặt dĩa SA. Sử dụng ống nghiệm ủó ủược khử trựng ủể dàn ủều dung dịch trờn bề mặt ủĩa.
ðĩa thạch phải khụng cú giọt nước ủọng nếu khuẩn lạc ủơn là ủược. Mang ủĩa thạch vào tủấm, giữ nhiệt ủộở 28oC trong khoảng thời gian từ 18 - 24h.
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ………47
Lấy 3 khuẩn lạc ủặc trưng trờn mẫu từ mụi trường thạch SA chuyển sang mụi trường TSI và thạch nghiờng Nutrient. Ủ ấm ở nhiệt ủộ 28oC qua ủờm. Khuẩn lạc Aeromanas ủặc trưng cú ủường kớnh từ 3-5 mm và cú mầu vàng ủến vàng mật trờn mụi trường thạch SA.
2.4. Giỏm ủịnh một số ủặc tớnh sinh vật húa học của những chủng vi khuẩn phõn lập ủược bằng phương phỏp thường quy.
a. Kiểm tra hỡnh thỏi và tớnh chất bắt màu bằng phương phỏp nhuộm Gram.
b. Kiểm tra khả năng di ủộng: Sử dụng mụi trường thạch mềm ( Mobility test medium) ủể kiểm tra di ủộng ủối với E.coli, Aeromonas spp và Salmonella spp.
c. Kiểm tra tớnh chất mọc của vi khuẩn trờn một số loại mụi trường lỏng, ủặc, trờn thạch mỏu hay một số mụi trường chọn lọc khỏc.
d. Kiểm tra ủặc tớnh lờn men ủường và khả năng sinh H2S của E.coli, Aeromonas spp và Salmonella spp trờn mụi trường thạch nghiờng KIA-mụi trường thạch 2 ủường dextrose và lactose (Kligler Iron Agar). Mụi trường cho phộp xỏc
ủịnh 4 tớnh chất sinh húa của vi khuẩn kiểm tra:
+ Tớnh chất lờn men ủường lactose tạo axit ở phần thạch nghiờng. + Tớnh chất lờn men ủường ở phần thạch ủứng.
+ Tớnh sinh hơi.
+ Tớnh chất sản sinh H2S.
e. Phản ứng Citrat.
ðể kiểm tra khả năng lợi dụng Carbon từ nguồn Citrat cú trong mụi trường của vi khuẩn E.coli, Aeromonas spp và Salmonella spp. Phản ứng này cú thể thực hiện ủược ở trờn 2 loại mụi trường: Mụi trường Simmons citrat hoặc Desoxycholate citrat agar. Vi khuẩn khụng lấy ủược carbon se khụng thể phỏt triển trờn mụi trường này, phản ứng cho kết quả õm tớnh.
f. Phản ứng sinh Indol.
Trong mụi trường dinh dưỡng Nutrient Broth (mụi trường khụng ủường cú Tryptophan), Vi khuẩn do cú Tryptophanase nờn cú thể phõn giải tryptophan ủể sản sinh Indol. Vi khuẩn sau khi cấy chuyển vào mụi trường ủược bồi dưỡng ở ủiều
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ………48
kiện nhiệt ủộ 44-45oC/24h, dựng thuốc thử Kowacs ủể kiểm tra. Phản ứng dương tớnh với một vũng trũn ủỏ tớm tỏch riờng ở trờn cựng.
g. Phản ứng Ure.
Vi khuẩn cần giỏm ủịnh ủược ria cấy trờn mụi trường thạch nghiờng Christensen agar cú bổ sung 5% ure 40% tinh khiết, bồi dưỡng trong tủ ấm 37oC/24h, ủọc kết quả dương tớnh khi mụi trường từ mầu vàng nhạt chuyển sang mầu ủỏ cỏnh sen và ngược lại là õm tớnh khi mụi trường khụng thay ủổi mầu sắc.
h. Một số phản ứng lờn men ủường (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Phản ứng này cho phộp kiểm tra tớnh chất lờn men một số loại ủường khỏc nhau của vi khuẩn cần giỏm ủịnh.
Trờn nền mụi trường dinh dưỡng khụng ủường (Nutrient Broth), bổ sung thờm 1,5ml xanh Bromothymol 1,5% trong cồn, trong 100ml dung dịch. Hấp ướt 110oC/30 phỳt, ủể nguội ủem chia vào cỏc ống nghiệm 1x12 cm, mỗi ống 3ml cú
ống Durham. Khi sử dụng cho thờm vào mụi trường 0,2ml dung dịch ủường cần kiểm tra ủó vụ trựng, cấy vi khuẩn vào và bồi dưỡng trong tủủấm 37oC/24h, sau ủú
ủọc kết quả. Phản ứng cho kết quả dương tớnh khi mụi trường chuyển mầu ủỏ cỏnh sen, kết quả õm tớnh khi mụi trường vẫn giữ nguyờn mầu sắc ban ủầu.
2.5. Xỏc ủịnh khả năng sản sinh ủộc tố của cỏc chủng E.coli, Aeromonas spp,
Salmonella spp.
a. Xỏc ủịnh khả năng sản sinh ủộc tố ruột của vi khuẩn E.coli, Aeromonas spp,
Salmonella spp bằng phương phỏp "phản ứng khuếch tỏn trong da thỏ" (Intradermal Test) theo Sandefur.P.D, Peterson.J.W (1976).
*Chuẩn bịủộc tố:
Chủng vi khuẩn E.coli, Salmonella, Aeromonas thuần khiết trờn mụi trường giữ giống ủược cấy chuyển sang 30ml mụi trường BHI lỏng, ủựng trong bỡnh tam giỏc loại 100ml, bồi dưỡng cú lắc ở ủiều kiện 37oC/24h. Huyễn dịch ủộc tố thu
ủược bằng cỏch li tõm canh trựng 10.000 - 12.000 vũng/phỳt ởủiều kiện lạnh, trong 10 phỳt. Bỏ cặn lấy nước trong và chia làm 2 phần:
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ………49 + Một phần bảo quản ở 4oC ủể thửủộc tố khụng chịu nhiệt. + Phần cũn lại ủun cỏch thủy ở 80oC trong 10 phỳt sau ủú bảo quản ở ủiều kiện 4oC, ủể thửủộc tố chịu nhiệt. *Chuẩn bịủộng vật thớ nghiệm: Chọn thỏ khỏe cú khối lượng 2,5 - 3kg, cắt trụi lụng ở phần lưng, xoa thờm kem rụng lụng ủể làm sạch hết phần chõn lụng cũn lại, dựng bỳt dạ chia mảng da này thành những ụ vuụng nhỏ cú kớch thước cạnh 2 ì 2cm.
Chớnh giữa mỗi ụ vuụng, tiờm nội bỡ 0,1 ml dịch ủộc tố ủó ủược chuẩn bị ở
trờn, mỗi mẫu tiờm 2 ụ ở 2 vị trớ xa nhau, ủối chứng õm là mụi trường BHI lỏng vụ trựng. Sau khi tiờm 18h với ủộc tố khụng chịu nhiệt và sau 2h với ủộc tố chịu nhiệt, thỏ thớ nghiệm ủược tiờm tĩnh mạch tai dung dịch Evan Blue, liều 40mg/kg thể
trọng. Nuụi tiếp 2h, giết thỏ, lột da ủọc kết quả phản ứng. *ðọc kết quả phản ứng:
+ Phản ứng ủược ủỏnh giỏ là dương tớnh khi ở trờn ụ vuụng thớ nghiệm vựng thẩm xuất Evan Blue cú diện tớch ≥ 16mm2 (4 ì 4mm).
+ Phản ứng cho kết quả õm tớnh khi ụ da lưng thỏ thớ nghiệm khụng cú vựng thẩm xuất Evan Blue.
+ Phản ứng ủược coi là nghi ngờ khi trờn ụ da thỏ cú vựng thẩm xuất Evan Blue nhưng diện tớch < 16 mm2.
2.6. Xỏc ủịnh ủộc lực của cỏc chủng vi khuẩn E.coli Aromonas spp và
Salmonella spp (Quinn. P. J et al, 1994) [69]. * Xỏc ủịnh ủộc lực của E.coli:
Tiờm xoang bụng chuột thớ nghiệm, liều 0,2 ml/con canh thang 24h/37oC chủng E.coli cần xỏc ủịnh, mỗi chủng tiờm 2 chuột. Theo dừi chuột chết trong thời gian 7 ngày. Chuột chết mổ khỏm kiểm tra bệnh tớch và phõn lập lại vi khuẩn.
* Xỏc ủịnh ủộng lực của Aeromonas spp và Salmonella:
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ………50
2.7. Xỏc ủịnh tớnh mẫn cảm của vi khuẩn E.coli, Salmonella, Aeromonas với một số lọai khỏng sinh và húa dược bằng phương phỏp khỏng sinh ủồ, theo Bauer. A. W, Kirby.W.M, Sheris. J. C, Turk. M (1966).
Kết quả thu ủược ủỏnh giỏ theo 4 mức ủộ mẫn cảm, căn cứ vào ủường kớnh vũng vụ khuẩn (Ф): + Rất mẫn cảm: (Ф) > 20 mm + Mẫn cảm trung bỡnh: (Ф) từ 15- 20 mm + Mẫn cảm yếu: (Ф) từ 10-14 mm + Khỏng thuốc: (Ф) < 10 mm 2.8. Xử lý và phõn tớch số liệu
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ………51
Chương 3: KẾT QUẢ NGHIấN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Khảo sỏt nguồn thức ăn nuụi cỏ rụ phi ở cỏc nụng hộ trờn ủịa bàn Hải Dương
Tiến hành khảo sỏt nguồn cung cấp và phương thức sử dụng thức ăn nuụi cỏ rụ phi của 4 xó với tổng số 13 hộ gia ủỡnh trờn ủịa bàn Hải Dương, kết quả thu ủược trỡnh bày ở bảng 3.1.
Từ bảng 3.1, cỏc kết quả cho thấy: Tất cả cỏc ủịa ủiểm khảo sỏt, nguồn thức ăn (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
ủịnh kỳ cho cỏ là cỏm hỗn hợp và một phần lớn chất thải chăn nuụi (phõn gia sỳc, gia cầm) chua qua xử lý (lợn nỏi sinh sản, lợn thịt, cú 13 hộ, chiếm 100%; vịt, cú 11 hộ, chiếm 84,61%; gà 2 hộ, chiếm 15,38%) sử dụng theo phương thức bổ sung trực tiếp, thường xuyờn.
Chớnh việc sử dụng trực tiếp nguồn chất thải trực tiếp này sẽ là nguy cơ rất lớn dẫn ủến ụ nhiễm mụi trường nước nuụi vỡ khụng kiểm soỏt ủược lượng chất thải cho xuống ao. Bờn cạnh ủú, việc sử dụng trực tiếp lượng phõn khụng qua xử lý cũng là nguyờn nhõn chớnh dẫn ủến tỡnh trạng mất an toàn vệ sinh thực phẩm. Trong phõn gia sỳc, gia cầm cú chứa rất nhiều vi sinh vật là mầm bệnh gõy bệnh cho người và
ủộng vật (ủặc biệt là những vi khuẩn gõy ngộủộc thực phẩm ủường tiờu húa: E.coli;
Salmonella spp; Aeromonas spp) (Trương Thị Dung, 2000 [3]; Health Protection Agency, 2006 [49]). Theo Nguyễn Thị Oanh và Phựng Quốc Chướng (2003) [15] thụng bỏo tỷ lệ nhiễm Salmonella trong phõn trõu, bũ tại ðaklak lần lượt là 45,43% và 41,25%. Cỏc loại vi khuẩn E.coli, Salmonella, Staphylococcus, Steptococcus là
những vi khuẩn hiếu khớ thường gặp trong ủường tiờu húa (phõn) chú khỏe mạnh cũng như chú viờm ruột tiờu chảy (Bựi Thị Tho, Nguyễn Thị Thanh Hà, 2007 [26]), theo Vừ Thị Trà An và cs (2006) Salmonella cú mặt trong phõn cỏc loại gia sỳc, gia cầm và tỷ lệ nhiễm ở phõn lợn cao hơn phõn gà, phõn bũ.
Song song với việc sử dụng phõn của cỏc loài gia sỳc gia cầm thỡ cỏc hộ nuụi cỏ rụ phi cũng sử dụng trực tiếp cỏc thức ăn cụng nghiệp hoặc thức ăn tự chếủể cho
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ………52
cỏ ăn. Tuy nhiờn, cụng tỏc bảo quản thức ăn khụng ủảm bảo và chế biến thức ăn cũn thủ cụng cũng dẫn ủến lõy nhiễm cỏc loại vi sinh vật gõy ngộ ủộc thực phẩm như
E.coli, Salmonella... theo Tống Vũ Thắng và ðậu Ngọc Hào, 2008 [23] thỡ khả năng nhiễm E.coli và Salmonella vào vật nuụi cú liờn quan chặt chẽ ủến sự hiện diện của chỳng trong mụi trường.
Từ kết quả khảo sỏt ban ủầu về tỡnh trạng sử dụng thức ăn và phương phỏp sử
dụng phõn trực tiếp trong nuụi cỏ rụ phi cho ta thấy nguy cơ ụ nhiễm về mầm bệnh cũng như cỏc chỉ tiờu vi sinh vật về vệ sinh an toàn thực phẩm là rất lớn trong cỏc ao nuụi trờn.
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ………53
Bảng 3.1. Kết quảủiều tra nguồn thức ăn nuụi cỏ rụ phi trờn ủịa bàn Hải Dương
Nguồn thức ăn nuụi cỏ rụphi
Thức ăn hỗn hợp Phõn và chất thải chăn nuụi gia sỳc, gia cầm
Lợn Vịt Gà ðịa ủiểm khảo sỏt (tờn xó) Nụng hộ khảo sỏt (tờn hộ) Diện tớch mặt nước (m2) dSụống (h hộ sửộ) T(%) ỷ lệ Số hộ sử dụng (hộ) Tỷ lệ (%) Số hộ sử dụng (hộ) Tỷ lệ (%) Số hộ sử dụng (hộ) Tỷ lệ (%) XQ 4000 BV 5000 VHa 3000 ðoàn Thượng VHc 2000 4 100 4 100 2 50 2 50 ðT 2500 PB 4000 Thạch Khụi NN 5000 3 100 3 100 3 100 0 0 VL 2000 VP 3000 Tõn Hưng CT 1500 3 100 3 100 3 100 0 0 VT 5000 HN 1000 Cương Xỏ NM 3500 3 100 3 100 3 100 0 0 Tớnh chung 13 13 100 13 100 11 84,61 2 15,38
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ………54
3.2. Khảo sỏt chỉ tiờu vi khuẩn E.coli trong mụi trường nước nuụi cỏ rụ phi.
Tiến hành thu mẫu nước ủể khảo sỏt chỉ tiờu ụ nhiễm E.coli. kết quả thu ủược trỡnh bày ở bảng 3.2:
Bảng 3.2. Kết quả khảo sỏt chỉ tiờu E.coli trong mụi trường nước nuụi cỏ rụ phi
Số mẫu dương tớnh Kết quảủịnh lượng l (cfu/ml) TT ðịa ủiểm (tờn hộ) Số mẫu kiểm tra n % X . 105 mX