Giống Aeromonas thuộc họ Vibrionaceae. Trong giống Aeromonas cú hai nhúm:
Nhúm 1: Aeromonas khụng di ủộng (Aeromonas salmonicida).
Nhúm 2: Là cỏc loài Aeromonas di ủộng, bao gồm Aeromonas hydrophyla,
Aeromonas caviae, Aeromonas sobria... ðặc tớnh chung của ba loài vi khuẩn này là di ủộng nhờ cú 1 tiờn mao. Vi khuẩn Gram õm dạng hỡnh que ngắn, hai ủầu trũn, kớch thước 0,5 x 1,0-1,5 àm. Vi khuẩn yếm khớ tuỳ tiện, Cytochrom oxidase dương tớnh, khử nitrate, khụng mẫn cảm với thuốc thử Vibriostat 0/129... Tỷ lệ Guanin + Cytozin trong ADN là 57 - 63 mol%.
Ba loài vi khuẩn Aeromonas di ủộng cú những ủặc ủiểm khỏc nhau (xem bảng 1.2). Sự hoại tử thử trờn mỏu thỏ của hai loài vi khuẩn Aeromonas hydrophyla khỏc với Aeromnas sobria. Aeromonas hydrophyla dung huyết trờn thạch mỏu khi nuụi cấy ở nhiệt ủộ 100C và 300C nhưng Aeromonas sobria chỉ dung huyết ở 300 C . Cỏc vi khuẩn Aeromonas di ủộng ủều phõn lập từ cỏ nước ngọt, thường gặp nhất là loài
Aeromonas hydrophyla. Ngoài ra cú thể gặp vi khuẩn Gram õm Pseudomonas fluorescens hoặc Proteus rettgeri.
Bảng 1.2: Một số ủặc ủiểm của cỏc loài vi khuẩn Aeromonas di ủộng (Popoff, 1984)
ðặc ủiểm A. hydrophila A. caviae A. sobria
- Di ủộng + + +
- Thuỷ phõn ascculin + + -
- Phỏt triển trong nước KCN + + -
- Sử dụng: L. Histidine + + - L. Arginine + + - L. Arabinose + + - - Lờn men Salixin + + - - Voges Proskauer + - + - Sinh H2S từ Glucose + - + - Sinh H2S từ Cysteine + - +
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ………37
1.6.2 Một số hiểu biết về khả năng gõy bệnh của Aeromonas gõy ra trờn người
Những loài vi khuẩn ủiển hỡnh thuộc giống Aeromonas là những loài vi khuẩn dưới nước, trong mụ bệnh cỏ và ủộng vật mỏu lạnh những loài cú mụi trường cư trỳ
ẩm ướt. Tuy vậy, Aeromonas ủược phõn lập từ nhiều loại thực phẩm khỏc nhau cú nguồn gốc ủộng vật như là: hải sản, sữa tươi, thịt bũ, thịt lợn, thịt cừu và thịt gia cầm. Chỳng phỏt triển ở nhiệt ủộ thấp.
Cú rất nhiều vi khuẩn thuộc giống Aeromonas cú thể gõy bệnh cho người, những bệnh chỳng gõy ra cho người; bệnh viờm dạ dày, viờm ruột; bệnh tiờu chảy và bệnh nhiễm trựng mỏu; Aeromonas allosaccharophila, Aeromonas hydrophila, Aeromonas jandaei, Aeromonas trota, Aeromonas veronii, Aeromonas sobria gõy tiờu chảy trờn người (N. B. Buller, 2004 [38]; J. Sha et al, 2002 [67]); Aeromonas
caviae, Aeromonas hydrophila, Aeromonas media, Aeromonas schubertii, Aeromonas sobria gõy viờm dạ dày và viờm ruột trờn người (N. B. Buller, 2004 [38]); Aeromonas caviae, Aeromonas schubertii gõy nhiễm trựng mỏu trờn người (N. B. Buller, 2004 [38]; Raafat A. M. Elbassuony, 2005 [71]).
Những yếu tố gõy ủộc của nhúm vi khuẩn Aeromonas: hamolysin, cytotoxin, enterotoxin, endotoxin, fimbriae hoặc adhesin (A. K. Chopra, 2000[42]; Inger Kuhn et al, 1997 [45]).
Những sản phẩm Enterotoxin cú thể ủược phỏt hiện bởi nhiều phõn tớch khỏc nhau trong phũng thớ nghiệm. Về mặt miễn dịch học giỏn tiếp chỉ ra rằng những loài vi khuẩn Aeromonas ủó từng ủược phỏt hiện trong một số ca bị viờm bao tử và ruột cú liờn quan ủến hải sản. Tuy nhiờn, khụng trường hợp nào ủược mụ tả bằng cỏc văn bản khoa học (Bonnie E. Rose và Anita J. G. Okrend, 1998; Moan-Shan Tsai và cs, 2005 [62]).
Một vài dũng thuộc vi khuẩn Aeromonas hydrophila cú khả năng gõy nhiễm khuẩn cho cỏ và ủộng vật lưỡng cư ủồng thời cũng thấy sự xuất hiện của chỳng trong ruột và vết thương của người, vi khuẩn Aeromonas hydrophila, Aeromonas sorbria, Aeromonas caviae là nguyờn nhõn gõy ra bệnh viờm ruột trờn người. Những loài khỏc như là: Aeromonas schubertii và Aeromonas jandaei cũng là
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ………38
những loài cú khả năng gõy bệnh cho con người và những loài sống trong nước trong khi ủú Aeromonas salmonicida ủược phõn lập từ mụ bệnh cỏ nhưng lại khụng
ủược chỳ ý trong sức khỏe của con người (Inger Kuhn và cs, 1997) [45].
Aeromonas ủược cho là sản xuất ra nhiều yếu tố gõy ủộc khỏc nhau như là: extracellular toxins, cytotoxins và enterotoxin. Hơn nữa, một số dũng thuộc vi khuẩn Aeromonas cú thể xõm nhập và tồn tại ở biểu mụ của tế bào. Mặc dự, những
ủặc tớnh này cú thểủược tỡm thấy khi phõn lập cỏc nguồn bệnh khỏc nhau, bao gồm cả con người mặc dự chưa thực sự rừ ràng (Inger Kuhn, 1997) [45].
1.6.3. Quy trỡnh phõn lập
Từ dóy nồng ủộ pha loóng cú thể cấy trực tiếp trờn bề mặt mụi trường thạch SA. Tuy nhiờn, nếu chỳng ta sử dụng phương phỏp tăng sinh thỡ sẽ phỏt hiện vi khuẩn Aeromonas tốt hơn, ủặc biệt trong trường hợp Aeromonas ủược lấy từ cỏc mẫu tự do hoặc mẫu cú số lượng thấp.
* Trộn 25g (25ml) mẫu trong 225 ml TSBA trong thời gian khoảng 2 phỳt sau
ủú ủem nuụi cấy ở nhiệt ủộ 28oC trong khoảng thời gian từ 18 - 24h.
* Sau khi nuụi cấy chuẩn bị dóy ống pha loóng của mụi trường tăng sinh trong BPD. Chuyển 0,1 ml của dóy nồng ủộ pha loóng từ 10-4 - 10-6 lờn trờn bề mặt dĩa SA. Sử dụng ống nghiệm ủó ủược khử trựng ủể dàn ủều dung dịch trờn bề mặt ủĩa. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
ðĩa thạch phải khụng cú giọt nước ủọng nếu khuẩn lạc ủơn là ủược. Mang ủĩa thạch vào tủấm, giữ nhiệt ủộở 28oC trong khoảng thời gian từ 18 - 24h.
* Lấy 3 khuẩn lạc ủặc trưng trờn mẫu từ mụi trường thạch SA chuyển sang mụi trường TSI và thạch nghiờng Nutrient. Ủ ấm ở nhiệt ủộ 28oC qua ủờm. Khuẩn lạc Aeromanas ủặc trưng cú ủường kớnh từ 3-5 mm và cú mầu vàng ủến vàng mật trờn mụi trường thạch SA.
1.6.4. Xỏc ủịnh ủặc tớnh sinh húa
* ðọc phản ứng trờn mụi trường TSI. Những phản ứng của Aeromonas trờn
mụi trường TSI: H2S õm tớnh; õm tớnh hoặc dương tớnh với phản ứng sinh hơi.
* Thực hiện phản ứng Oxidase trờn mụi trường thạch nghiờng Nutrient. Cho một vài giọt dung dịch N,N-dimethyl-p-phenylenediamine monohydrochloride ủể
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ………39
quan sỏt phản ứng trờn mụi trường thạch nghiờng SA. Oxidase dương tớnh sẽ phỏt triển một mầu hồng, mầu hồng này liờn tiếp chuyển sang mầu nõu sẫm, mầu ủỏủậm và mầu ủen trong khoảng thời gian từ 10 - 30 phỳt. Tất cả cỏc loài Aeromonas ủều cú phản ứng Oxidase dương tớnh và phản ứng lờn men.
* Chuyển tất cả những mẫu cú phản ứng dương tớnh từ mụi trường thạch nghiờng TSI sang cỏc mụi trường dưới ủõy ủể thử phản ứng sinh húa: manitol fermentation, arginine decarboxylase broth, ornithine decarboxylase broth, glucose fermentation broth and bile esculin agar. Sau khi cấy, mụi trường decarboxylase
ủược phủ một lớp dầu khoỏng và ủở nhiệt ủộ 28oC trong 48h.
* ðọc phản ứng sinh húa dựa vào cỏc ủặc ủiểm của chỳng. Tất cả Aeromonas
ủều sản sinh acid từ manitol và arginine dương tớnh, ornithine õm tớnh. Những loài thuộc nhúm A. hydrophila cú thể cú sự khỏc nhau về kết quả của cỏc phản ứng sinh húa ủược chỉ ra ở bảng dưới ủõy.
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ………40
Chương 2: ðỐI TƯỢNG, ðỊA ðIỂM, THỜI GIAN
VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIấN CỨU
2.1. ðối tượng, ủịa ủiểm và thời gian nghiờn cứu
2.1.1 Vật liệu nghiờn cứu
Cỏc loại thiết bị, hoỏ chất và mụi trường cần thiết ủể nuụi cấy, phõn lập vi khuẩn.
2.1.2. ðối tượng nghiờn cứu
Cỏc vi khuẩn trongcỏ rụ phi và mụi trường nước ao nuụi cỏ Rụ phi.
- Thời gian nghiờn cứu: Từ thỏng 04 – 10/2008
- ðịa ủiểm nghiờn cứu:
Hải Dương
Phũng thớ nghiệm khoa Chăn nuụi – Thỳ y, trường ðại học Nụng lõm Thỏi Nguyờn.
2.2. Phương phỏp thu mẫu
2.2.1. Phương phỏp thu, bảo quản và chuẩn bị mẫu nước
* Phương phỏp thu và bảo quản mẫu nước
- Sử dụng chai thủy tinh ủó khử trựng.
- Chọn ủiểm thu mẫu theo chiều sõu: thu mẫu cỏch bề mặt từ 30-50cm. - Chọn ủiểm thu mẫu theo bề mặt: Dựa trờn nguyờn tắc ủịnh ủiểm thu mẫu. - Lấy mẫu theo phương phỏp ngẫu nhiờn.
Sau khi lấy ủược mẫu nước, ủể cỏc chai mẫu vào trong phớch ủỏ và vận chuyển về phũng thớ nghiệm bảo quản trong ngăn lạnh và tiến hành phõn tớch mẫu. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
* Chuẩn bị mẫu nước
Tiến hành pha loóng mẫu trong nước muối sinh lý theo dóy nồng ủộ từ 101 - 106ủể phõn tớch.
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ………41
2.2.2. Phương phỏp thu, bảo quản và chuẩn bị mẫu cỏ
* Phương phỏp thu và bảo quản mẫu cỏ
- Sử dụng vú ủặt ở cỏc ủiểm khỏc nhau ủể thu mẫu nhằm ủảm bảo tớnh ủại diện của mẫu.
- Cỏ ủược cho vào tỳi nilon (ủó khử trựng) sau ủú ủể trong phớch ủỏ ủể bảo quản mẫu khi vận chuyển.
*Phương phỏp chuẩn bị mẫu
Với chỉ tiờu E.coli và Aeromonas spp
- Lấy 10g mẫu nghiền nhỏ rồi cho vào bỡnh tam giỏc chứa 90 ml dung dịch BPW lắc ủều sau ủú ủem ủấm ở 37oC trong khoảng thời gian từ 18 - 24h.
Với chỉ tiờu Salmonella
- Lấy 25g mẫu nghiền nhỏ rồi cho vào bỡnh tam giỏc chứa 90 ml dung dịch BPW lắc ủều sau ủú ủem ủấm ở 37oC trong khoảng thời gian từ 18 - 24h.
2.3. Phương phỏp phõn tớch mẫu
2.3.1. Xỏc ủịnh chỉ tiờu Coliform tổng số
- Chuẩn bị mụi trường dinh dưỡng ủường lactose (loóng): Mụi trường Nutrient broth (1000ml) bổ sung 5g lactose + 1,5ml Bromothymolblue (dung dịch 1,5% trong cồn), hấp ướt 121OC/15 phỳt. Chia vào ống nghiệm, 5ml/ống cú ống Durham, bảo quản 8- 10OC, dựng trong 1 tuần.
- Chuẩn bị mụi trường dinh dưỡng ủường lactose (ủặc): Mụi trường Nutrient broth (1000ml) bổ sung 10g lactose + 1,5ml Bromothymolblue (dung dịch 1,5% trong cồn), hấp ướt 121OC/15 phỳt. Chia vào ống nghiệm, 10ml/ống cú ống Durham, bảo quản 8- 10OC, dựng trong 1 tuần.
- Mụi trường Brillant green bile broth 2% pha theo hướng dẫn ở trờn, chia vào cỏc ống nghiệm cú ống Durham, 5ml/ống.
Tiến hành xột nghiệm bước 1 - cấy trờn mụi trường dinh dưỡng ủường lactose: Mẫu pha loóng theo phương phỏp nhiều ống, mỗi nồng ủộ sử dụng 3 ống ( cũn gọi phương phỏp 9 ống). Sau khi cấy, cỏc ống nghiệm ủược bồi dưỡng 37OC/24- 48h. Lưu ý ghi lý lịch, ủỏnh số thứ tự cho cỏc ống nghiệm.
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ………42
- 3 ống canh thang lactoz ủặc, mỗi ống cấy 1ml mẫu nguyờn. Dương tớnh cả, ghi 3.
- 3 ống canh thang lactoz loóng, mỗi ống cấy 1ml mẫu nguyờn. Dương tớnh cả, ghi 3.
- 3 ống canh thang lactoz loóng, mỗi ống cấy 1ml mẫu pha loóng 10-1. Dương tớnh cả, ghi 3.
- 3 ống canh thang lactoz loóng, mỗi ống cấy 1ml mẫu pha loóng 10-2. Chỉ
dương tớnh 2, ghi 2.
- 3 ống canh thang lactoz loóng, mỗi ống cấy 1ml mẫu pha loóng 10-3. Âm tớnh cả, ghi 0. Ở cỏc nồng ủộ pha loóng tiếp theo làm tương tự.
- Chỳ ý: Nếu tất cả cỏc ống nghiệm ủều cho dương tớnh, cần tiếp tục pha loóng mẫu ớt nhất thờm 2 nồng ủộ nữa ( 10-4, 10-5).
→ Kết quả bước 1 thu ủược 3 3 3 2 0, chọn 3 2 0.
Tiến hành xột nghiệm bước 2 - cấy trờn mụi trường Brilliant green bile broth 2%: Chọn cỏc ống dương tớnh cấy chuyển tiếp sang mụi trường Brilliant green bile broth 2%. Từ kết quảủó chọn 3 2 0, cũng cú thể chọn thờm ngẫu nhiờn 1 nồng ủộ ủặc hơn dương tớnh cả ( chẳng hạn chọn 3 ống cấy 1ml mẫu nguyờn). Tổng cộng cú 8 ống phải cấy chuyển. Ghi lý lịch, ủỏnh số thứ tự.
Dựng que cấy hoặc pipet man cấy chuyển mẫu dương tớnh sang mụi trường Brilliant green bile broth 2%( 0,5 ml/ống), chỳ ý thay ủầu pipet hoặc khử trựng que cấy. Bồi dưỡng cỏc ống xột nghiệm 37OC/24- 48h. ðọc kết quả phản ứng:
- 3 ống cấy chuyển từ canh thang lactose cú cấy 1ml mẫu nguyờn, dương tớnh cả, ghi 3. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- 3 ống cấy chuyển từ canh thang lactose cú cấy 1ml mẫu pha loóng 10-1, dương tớnh cả, ghi 3.
- 3 ống cấy chuyển từ canh thang lactose cú cấy 1ml mẫu pha loóng 10-2, chỉ
dương tớnh 1, ghi 1.
→ Kết quả bước 2 thu ủược 3 3 1, ghi ủầy ủủ sẽ là 3 3 3 1 0, chọn 3 1 0 ủể
tra bảng MPN.
→ Kết quả tra bảng MPN ủược 43/100ml cú nghĩa ủược xỏc ủịnh 4.300 vi khuẩn nhúm Coliform/1ml mẫu nước hay tổng số Coliform xỏc ủịnh 4,3.103/ml nước (hoặc 1 gam sản phẩm ủộng vật).
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ………43
Bảng 2.1: Chỉ số MPN cho phương phỏp nhiều ống(phương phỏp 9 ống) Sốống dương tớnh MPN/100ml Giới hạn tin cậy 000 0 0,5- 9 010 3 0,5- 13 100 4 0,5- 20 110 7 1- 23 120 11 3- 36 200 9 1- 36 210 15 3- 44 220 21 4- 47 300 23 4- 120 310 43 7- 210 320 93 15- 380 321 150 30- 440 322 210 35- 470 330 240 36- 1300 331 460 71- 2.400 332 1.100 150- 4.800 333 >2.400
2.3.2. Xột nghiệm chỉ tiờu fecal Coliform:
Cỏc bước tiến hành tương tự với Coliform, chỉ khỏc sau khi cấy chuyển cỏc
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ………44
green bile broth 20%, cỏc ống mụi trường sẽ ủược bồi dưỡng ởủiều kiện 43oC/24- 48h, cỏch tớnh kết quả tra bảng MPN.
* Kỹ thuật ria cấy, phõn lập vi khuẩn trờn mụi trường thạch ủó:
Ria cấy phõn lập khuẩn lạc
* Vi khuẩn Coliform:
Là những vi khuẩn ủường ruột, gram õm, hiếu khớ hoặc yếm khớ tuỳ tiện, khụng sinh nha bào, cú khả năng lờn men lactose sinh axit và sinh hơi ở 35- 37oC/24-48h. Chỳng thường ủược tỡm thấy trong phõn người, gia sỳc và trong mụi trường tự nhiờn (nước, ủất...). Coliform ủược coi là chỉủiểm vệ sinh quan trọng. Sự
cú mặt của Coliform chứng minh biện phỏp khử trựng chưa ủạt hiệu quả.
Nhúm Coliform hay gặp: E.coli, Enterobacter aerogenes, Klebsiella
pneumoniae, Citrobacter diversus (26-75%).
* Nhúm fecal Coliform:
Là những Coliform chịu nhiệt, phỏt triển ủược ở nhiệt ủộ 44,5oC + 0,2, chỉ cú trong phõn người và ủộng vật mỏu núng. Do vậy, fecal Coliform ủược coi là chỉ ủiểm vệ sinh quan trọng. Sự cỳ mặt của fecal Coliform trong tự nhiờn, nguồn nước, sản phẩm ủộng vật vv.., chứng tỏ cú sự ụ nhiễm phõn người hoặc gia sỳc. ðại diện
ủiển hỡnh của fecal Coliform là E.coli.
2.3.3. Phương phỏp lấy mẫu thịt
Lấy mẫu, bảo quản và phõn tớch theo TCVN 4833 (1993), FAO(1992).
Cỏ rụ phi ủược bỏ võy, vụ trựng bề mặt da bằng cỏch tẩm cồn 96o, rửa lại bằng nước cất vụ trựng, bỏ xương lấy thịt cõn ủịnh lượng mẫu nghiờn cứu.
1
2
3 4
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ………45
* Xỏc ủịnh chỉ tiờu E.coli trong 1g thịt trờn mụi trường Macconkey agar: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
ðồng nhất và pha loóng mẫu: Cõn 10g thịt tươi nghiền nỏt trong cối sứ, nghiền tiếp bằng mỏy xay thịt, cho vào bỡnh tam giỏc 500, bổ sung 90ml dịch dinh dưỡng