- Mẫu nước sử dụng tại các cơ sở giết mổ
2.3.6.Phương pháp phát hiện Salmonella
Quy trình phát hiện Salmonella cần qua bốn giai ựoạn kế tiếp nhau Tăng sinh sơ bộ trong môi trường lỏng không chọn lọc: cấy phần mẫu thử trong dung dịch ựệm pepton ở nhiệt ựộ phòng sau ựó ủ ở 370Cổ1 trong 18
ổ 2giờ. đối với số lượng lớn thì làm nóng dung dịch ựệm pepton ựến 370Cổ10C trước khi cấy mẫu thử
Tăng sinh trong môi trường lỏng chọn lọc: Cấy dịch tăng sinh chọn lọc thu ựược vào môi trường Rappaport-Vassiliadi (môi trường RVS) và môi trường Tetrathionat/novobioxin muller-kauffmann( môi trường MKTTn). Môi trường RVS ựược ủ ở 24 ổ 3giờ/41,5 ổ 10C và môi trường MKTTn ựược ủ ở 24 ổ 3giờ/ 37 ổ 10C
đổ ựĩa và nhận dạng
Cấy dịch tăng sinh thu ựược trong mục trên vào hai môi trường ựặc chọn lọc Thạch deoxycholat lyzin xyloza (thạch XLD)
Thạch XLD ựược ủ ở 37 ổ 10C và ựược kiểm tra sau 24 ổ 3giờ. Khẳng ựịnh ựể nhận dạng
Trường đại Học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp 30 và khẳng ựịnh ựể nhận dạng chúng bằng phép thử sinh hóa.
- Khẳng ựịnh sinh hóa:
Thạch Ure: cấy ria trên bề mặt nghiêng của thạch ủ ở 37 ổ 10C trong 24 ổ 3giờ và kiểm tra thường xuyên. Nếu phản ứng dương tắnh thì sự phân giải ure thành amoniac làm phenol màu ựỏ chuyển thành màu hồng và sau ựó chuyển thành màu ựỏ hồng. Phản ứng thường xuất hiện sau 2 Ờ 4 giờ
Môi trường L-lyzin ựã khử nhóm cacboxyl: cấy ngay dưới bề mặt của môi trường lỏng ủ ở 37 ổ 10C trong 24 ổ 3giờ, màu ựục và ựỏ tắa sau khi ủ chứng tỏ phản ứng dương tắnh, màu vàng là phản ứng âm tắnh
Môi trường phản ứng indol: cấy khuẩn lạc nghi ngờ vào ống chứa 5ml môi trường trypton/tryptophan ủ ở 37 ổ 10C trong 24 ổ 3giờ, sau khi ủ thêm 1ml thuốc thử Kovacs, nếu có xuất hiện một vòng màu ựỏ chứng tỏ phản ứng dương tắnh + Sơ ựồ phân lập, giám ựịnh:
Cho 25gam thịt lợn cho vào túi ựựng mẫu
Thêm 225ml dung dịch ựệm pepton vào ở nhiệt ựộ phòng Ủ 370C ổ 10C trong 18 ổ 2giờ
Chuyển 0,1ml dung dịch huyền phù ban ựầu vào ống nghiệm có chứa 10ml RVS (Rappaport-Vassiliadis) ủ 41,5 ổ 10C trong 24 ổ 3giờ và 1ml dung
dịch huyền phù vào 10ml dung dịch Muller-Kauffmann (KMNTTn) ủ 370C ổ 10C trong 24 giờ
Cấy chuyển vào môi trường thạch XLD, ủ 370C ổ 10C trong 24 giờ Từ mỗi ựĩa thử một khuẩn lạc ựặc trưng, nếu âm tắnh thử 4 khuẩn lạc
khác ựược ựánh dấu
Cấy vào thạch dinh dưỡng ủ 370C ổ 10C trong 24giờ ổ 3giờ Kiểm tra phản ứng sinh hóa
Trường đại Học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp 31
2.3.7. Phương pháp ựịnh lượng S. aureus
Cấy lên bề mặt của môi trường cấy ựặc chọn lọc, sử dụng hai ựĩa, dùng một lượng huyền phù ban ựầu. Trong cùng một ựiều kiện, cấy các dung dịch pha loãng thập phân của huyền phù ban ựầu, dùng hai ựĩa cho mỗi ựộ pha loãng.
Ủ các ựĩa trong ựiều kiện hiếu khắ 370C và kiểm tra sau 24 giờ và 48 giờ. Tắnh số lượng vi khuẩn có phản ứng dương tắnh với coagulase trong một ml từ số lượng khuẩn lạc ựiển hình hoặc không ựiển hình trên các ựĩa ở các ựộ pha loãng chọn sao cho kết quả có ý nghĩa và ựược khẳng ựịnh bằng kết quả thử coagulase dương tắnh.
+ Sơ ựồ phân lập, giám ựịnh:
Cho 10 gam thịt lợn cho vào túi ựựng mẫu Thêm 90 ml dung dịch ựệm pepton ở nhiệt ựộ phòng
Ủ 37 ổ 10C trong 24 ổ 2giờ
Lấy 1ml ở huyền phù ban ựầu cho vào 09ml pepton ựệm pha loãng ra các nồng ựộ 10-2, 10-3
Cấy chuyển 0.33ml huyền phù ban ựầu và 0,33ml ở các ống nồng ựộ 10-2, 10-3 vào môi trường thạch Bair Parker, ủ 37 ổ 10C trong 48 ổ 3giờ
Chọn 5 khuẩn lạc ựiển hình và 5 khuẩn lạc không ựiển hình
BHI (5ml) 1 ống ủ 370C trong 24 ổ 2giờ Chuyển 0,1ml chủng vào 0.3 ml huyết tương thỏ
Kiểm tra sự kết dắnh của huyết tương thỏ sau khi ủ từ 4 - 6 giờ.
Trường đại Học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp 32
Bảng 2.1. đọc kết quả theo bảng Sperber và Tatini
Huyết tương thỏ ựông cứng sau 4-6 giờ khó di ựộng 4+ Xác ựịnh là S. aureus
Huyết tương thỏ ựông chắc sau 6 giờ dễ di ựộng 3+ Không ựược xem là S .aureus
Huyết tương thỏ ựông thành cục nhỏ sau 24 giờ 2+ Không ựược xem là S. aureus
Huyết tương thỏ ựông thành cục nhỏ sau không liên
kết thành khối 1+
Không ựược xem là S. aureus