II. NỘI DUNG
3.4. Ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy đến hiệu quả chuyển gen
Đồng nuôi cấy là khoảng thời gian vi khuẩn đã bám vào mẫu mô có điều kiện tăng sinh số lượng trên môi trường rắn. Sự chuyển đoạn T-DNA vào
genome thực vật cũng xảy ra vào thời gian này. Nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng nếu thời gian đồng nuôi cấy quá ngắn thì quá trình biến nạp có thể không hoàn toàn, trong khi đó thời gian đồng nuôi cấy dài có thể ảnh hưởng không tốt đến quá trình biến nạp do ái lực của vi khuẩn với tế bào thực vật sẽ giảm hoặc sẽ ức chế cạnh tranh. Để khảo sát ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm cũng như thời gian đồng nuôi cấy đến hiệu quả chuyển gen, các mẫu lá mầm Hoàng liên gai được lây nhiễm với dịch huyền phù vi khuẩn OD600 = 0,5 trong thời gian 20 phút và đồng nuôi cấy trong tối từ 24 đến 72 giờ
Bảng 3.10: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy đến hiệu quả chuyển gen
Thời gian đồng
nuôi cấy (giờ) Tổng số mẫu
Số mẫu biểu hiện gus
Tỷ lệ biểu hiện gus
(%)
24 70 18 25,72 ± 4,39
48 70 27 38,7 ± 4,048
72 66 21 31,77 ± 1,67
Qua bảng 3.10 ta thấy thời gian đồng nuôi cấy ngắn, vi khuẩn xâm nhập ít nên khả năng chuyển nạp gen vào tế bào thấp nên tỷ lệ mẫu bắt màu thấp. Thời gian đồng nuôi cấy dài vi khuẩn xâm nhập vào mô nhiều nên tăng khả năng chuyển gen vào tế bào. Khi đồng nuôi cấy mẫu trong 24 giờ, hiệu quả
chuyển gen là thấp nhất 25,72 % mẫu lá mầm có dấu hiệu biểu hiện gen gus
qua phương pháp nhuộm mô tế bào. Mặt khác, nếu thời gian đồng nuôi cấy dài, hiệu quả chuyển gen giảm do lượng vi khuẩn phát sinh lớn sẽ gây hại trực tiếp đến mẫu mô thực vật. Ở thời gian đồng nuôi cấy 72 giờ, hiệu quả chuyển gen chỉ đạt 31,77 % ở mẫu lá mầm. Trong khi đó, thời gian đồng nuôi cấy trong 48 giờ cho hiệu quả chuyển gen là cao nhất. Với mật độ vi khẩn OD600= 0,5 thời gian lây nhiểm 20 phút, thời gian đồng nuôi cấy 48 giờ cho hiệu quả chuyển gen lên đến 38,7 % ở mẫu lá mầm Hoàng liên gai (hình 3.9)
Hình 3.9: Ảnh hưởng thời gian đồng nuôi cấy đến hiệu quả chuyển gen. a, b,c: Thời gian đồng nuôi cấy 24, 48, 72 giờ.
Nghiên cứu về chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium trên cây cọ dầu của Sureerat and Sompong (2012) cho thấy thời gian đồng nuôi cấy hiệu quả là 3 ngày, thời gian đồng nuôi cấy trong thời gian dài từ 5 - 6 ngày làm giảm khả năng chuyển gen và làm vi khuẩn phát sinh mạnh, giảm khả năng phục hồi của tế bào[41]. Tương tự trên cây lúa, dứa, đậu xanh
thời gian đồng nuôi cấy 3 ngày với vi khuẩn Agrobacterium cho hiệu quả
cao nhất. Trên cây Brassica napus và Brassica rapa thì thời gian đồng nuôi cấy 72 giờ với vi khuẩn Agrobacterium thì tỷ lệ mẫu bắt màu cao hơn so với đồng nuôi cấy 0 giờ, 24 giờ và 48 giờ (Khan et al., 2009)[23]. Khi nghiên cứu thời gian đồng nuôi cấy trên cây đậu xanh thì thu được kết quả đồng nuôi cấy 3 ngày cho tỷ lệ biểu hiện gen gus cao nhất, tiếp tục tăng thời gian đồng nuôi cấy thì hiệu quả chuyển gen giảm do vi khuẩn phát triển quá mức (Yadav et al., 2012) [23], [47].
3.4. Bước đầu thu nhận kết quả chuyển gen cho sự hình thành rễ tơ.
Sau khi tiến hành khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chuyển gen, chúng tôi thực hiện 3 lô thí nghiệm chuyển gen tạo rễ tơ vào đối tượng cây Hoàng liên liên gai độc lập. Nguồn vật liệu sử dụng là lá mầm, mật độ vi
khuẩn OD600 0,5, thời gian lây nhiễm 20 phút và đồng nuôi cấy trong 48 giờ. Kết quả chuyển gen thể hiện ở bảng 3.11
Bảng 3.11: Kết quả chuyển gen tạo rễ tơ ở cây Hoàng liên gai Lô thí nghiệm Tổng số mẫu Số mẫu biểu hiện rễ tơ Tỷ lệ biểu hiện rễ tơ (%)
1 128 17 13,28
2 89 11 12,35
3 153 22 14,37
Tổng số 370 50 13,33 ± 1,011
Kết quả chuyển gen tạo rễ tơ ở cây Hoàng liên gai trên nguồn vật liệu lá mầm cho hiệu quả chuyển gen thấp hơn so với kết quả khảo sát hiệu quả chuyển gen dựa trên sự biểu hiện của gen gus. Sau khi thực hiện 3 lô thí nghiệm độc lập, chỉ có trung bình 13,33 % mẫu lá mầm biểu hiện rễ tơ. Trong khi đó, có đến 38,7% mẫu lá biểu hiện gus. Hiện tượng này có thể do chúng tôi dùng gen gus để tối ưu quy trình, thời gian biểu hiện gen gus ngắn, trong khi để tạo kiểu hình rễ tơ cần thời gian lâu hơn và cần có sự kết hợp của nhiều yếu tố tạo rễ như các gen rol hay các gen auxin. Do đó, hiệu quả chuyển gen tạo rễ tơ thực tế ở đối tượng Hoàng liên gai chỉ dao động từ 12,35 % đến 14,37 % mẫu lá mầm có khả năng tạo kiểu hình rễ tơ.
Hình 3.10: Kết quả chuyển gen tạo rễ tơ ở cây Hoàng liên gai; a) Các mẫu lá mầm trên môi trường diệt khuẩn sau 6 tuần; b) Mẫu lá mầm tạo kiểu hình rễ
tơ; c) Lông hút trên rễ tơ Hoàng liên gai
Sau khi chuyển các mẫu lá lên môi trường diệt khuẩn, các mẫu lá tiếp tục phát triển kích thước. Sau một thời gian đặt mẫu trong điều kiện tối, các mảnh lá mẩm mất dần màu xanh của diệp lục và trở nên vàng. Một số mẫu lá bị thâm nâu và chết sau 3 – 4 được cấy chuyển lên môi trường diệt khuẩn. Sau 5 – 6 tuần sau khi biến nạp, một số mẫu lá bắt đầu có sựu hình thành kiểu hình rễ tơ (Hình 3.10b). Rễ tạo thành có nhiều lông hút bao quanh (Hình 3.10c) và có thể phát triển trên môi trường không có chất điều hòa sinh trưởng, đây là các đặc điểm điển hình của rễ tơ.