II. NỘI DUNG
2.3.1.Thu thập và nhận dạng loài bằng chỉ thị phân tử
- Thu thập ngoài thực địa: Dựa vào đặc điểm hình thái, sinh thái của cây Hoàng liên gai và vùng phân bố của chúng, tôi tiến hành thu thập mẫu tại Vườn Quốc gia Hoàng liên - Sa Pa – Lào Cai.
- Phương pháp xác định loài bằng chỉ thị DNA: Việc định loài giúp ta tránh việc sử dụng nhầm đối tượng nghiên cứu. Qui trình xác định loài bằng chỉ thị phân tử gồm các bước:
Tách chiết và tinh sạch DNA: Các mẫu lá Hoàng liên gai được tiến hành tách chiết DNA bằng phương pháp CTAB theo Saghai-Maroof et al., 1984 [34].
Tinh sạch và giải trình tự sản phẩm PCR: DNA tổng số sau khi tách chiết thành công được sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR với như sau: bước 1: 94oC, 5 phút; bước 2: 94oC, 30s; bước 3: 54oC, 50s; bước 4: 72oC, 1 phút; từ bước 2 đến bước 4 lặp lại 30 chu kì; bước 5: 72oC, 10 phút; bước 6: 4oC bảo quản mẫu.
Sản phẩm PCR sau đó được điện di trên gel agarose 1% trong đệm 1X
TAE, nhuộm gel trong dung dịch Ethidium brommide và tinh sạch bằng kit
thôi gel của QIAamp. Chúng tôi tiến hành phản ứng PCR với các mồi sau:
Bảng 2.1: Thông tin các mồi sử dụng trong nghiên cứu
STT Tên mồi hiệu Ký Trình tự mồi (5’- 3’)
1 psbA-trnH P10F P10R GTTATGCATGAACGTAATGCTC CGCGCATGGTGGATTCACAATCC
2 ITS P12F ACGAATTCATGGTCCGGTGAAGTGTTCG
P12R TAGAATTCCCCGGTTCGCTCGCCGTTAC
3 rpoB P5F AAGTGCATTGTTGGAACTGG
P5R GATCCCAGCATCACAATTCC
4 rpoC1 P6F P6R GTGGATACACTTCTTGATAATGG CCATAAGCATATCTTGAGTTGG
6 trnL P11F P11R CGAAATCGGTAGACGCTACG GGGGATAGAGGGACTTGAAC
Tách dòng và xác định trình tự gen: Sản phẩm PCR sau tinh sạch được
gắn vào vector tách dòng pBT và biến nạp vào tế bào khả biến E.coli DH5-α theo phương pháp sốc nhiệt của Cohen et al.(1972). Chọn lọc khuẩn lạc
xanh/trắng trên môi trường thạch LB có bổ xung 50mg/l Carbenicilin, 0,004% X-gal và 0,1mM IPTG. Tách plasmid theo hướng dẫn của bộ Kit tách plasmid (Bioneer, Hàn Quốc) và của Sambrook và Russell (2001). Kiểm tra sự có mặt của DNA tái tổ hợp bằng phương pháp clony-PCR với cặp mồi pUC18-F và pUC18-R. Trình tự DNA các đoạn gen rpob, rpoC1, psbA-trnH, trnL, ITS của hai mẫu Hoàng liên gai được xác định bằng máy đọc trình tự tại Phòng Thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Các trình tự được phân tích và so sánh bằng phần mềm BioEdit, DNAstar và dựng cây phát sinh chủng loại trên cơ sở dữ liệu thu được.