II. NỘI DUNG
1.3.Các nghiên cứu ứng dụng chỉ thị DNA vào việc xác định loài
Trong nghiên cứu này, việc thu thập các nguồn mẫu cây Hoàng liên gai ngoài tự nhiên làm nguyên liệu cho nuôi cấy là một việc cần thiết. Tuy nhiên nguồn nguyên liệu ngoài tự nhiên nếu chỉ dựa vào hình thái và kinh nghiệm dân gian đôi khi dễ nhầm lẫn với những đối tượng cây có hình thái tương tự sống tại cùng một khu vực. Điều này có ảnh hưởng không nhỏ đến nghiên cứu. Do đó việc nhận dạng các mẫu cây ngoài tự nhiên bằng phương pháp sinh học phân tử sẽ mang ý nghĩa rất quan trọng.
Trong vài thập kỷ gần đây, sự phát triển mạnh mẽ của các phương pháp và kỹ thuật sinh học phân tử đã tạo ra các công cụ hữu hiệu cho các nghiên cứu sự sống ở mức độ phân tử. Các kỹ thuật sinh học phân tử cũng nhanh
chóng được ứng dụng trong nghiên cứu và bảo tồn đa dạng sinh học, nhận dạng loài, tạo ra các lĩnh vực khoa học mới như tiến hóa phân tử, di truyền và bảo tồn loài. Đặc biệt, đối với lĩnh vực phân loại học, việc sử dụng các DNA chỉ thị để nhận dạng loài đang được các nhà khoa học trên thế giới tập trung nghiên cứu và có những đóng góp đáng kể trong việc phân loại loài. Nhận
dạng loài bằng chỉ thị DNA hay “DNA barcoding” là một khái niệm tương
đối mới mẻ. Đó là công cụ phục vụ nhận dạng loài một cách chính xác, nhanh chóng, tự động hóa bằng cách sử dụng một vùng DNA chuẩn hay còn gọi là
chỉ thị DNA hay mã vạch DNA (DNA barcoding). Xác định loài bằng DNA
chỉ thị sẽ cho mức độ chính xác cao và đặc biệt hữu dụng với các loài gần gũi và những quan sát hình thái, sinh trưởng và phát triển chưa đủ cơ sở để nhận dạng hoặc phân biệt loài [24],[25].
Hiện nay trên thế giới, phương pháp này đang được sử dụng chủ yếu bởi các nhà phân loại học và nhiều nhà khoa học ở các lĩnh vực khác như khảo cổ học, công nghiệp sinh học và chế biến thực phẩm…
Đối với thực vật, quá trình tìm kiếm một chỉ thị DNA chung cho các loài thực vật gặp nhiều khó khăn. Hệ gen ty thể ở thực vật thường quá bảo thủ nên không được dung cho thỉ thị DNA, trong khi đó hệ gen lục lạp lại mang nhiều đặc điểm mong muốn đối với chỉ thị DNA như ở hệ gen ty thể ở động vật [44]. Ở hệ gen nhân, vùng DNA nằm giữa các gen hay còn gọi ITS (Internal Transcribed Spacer) cũng được sử dụng làm DNA chỉ thị trong một số nghiên cứu..
Trong vài năm trở lại đây nhiều vùng gen đã được nghiên cứu và đề xuất làm chỉ thị DNA cho thực vật tuy nhiên chưa có chỉ thị DNA nào được đa phần các nhà phân loại học thực vật hoàn toàn chấp nhận[25],[44]. Mặc dù vậy, các nhà nghiên cứu cũng đã đi tới một quan điểm thống nhất là sẽ cần
không chỉ một mà nhiều vùng DNA chỉ thị để định danh loài đối với thực vật và hệ gen lục lạp là nơi chứa các vùng DNA chỉ thị tiềm năng, trong đó một số vùng DNA lục lạp đã được nhiều nhà nghiên cứu đề xuất là chỉ thị DNA [13],[14],[43].
Chỉ thị DNA barcode là một trong những phương pháp phổ biến có độ
chính xác cao đã được nhiều nghiên cứu trong và ngoài nước sử dụng. Nhiều vùng gen đã được nghiên cứu và đề xuất làm chỉ thị DNA cho thực vật [13],[25],[43] tuy nhiên chưa có chỉ thị DNA nào được đa phần các nhà phân loại học thực vật hoàn toàn chấp nhận [13],[16]. Mặc dù vậy, các nhà nghiên cứu cũng đã đi tới một quan điểm thống nhất là sẽ cần không chỉ một mà nhiều vùng DNA chỉ thị để xác danh loài đối với thực vật và hệ gen lục lạp là nơi chứa các vùng DNA chỉ thị tiềm năng, trong đó một số vùng DNA lục lạp đã được nhiều nhà nghiên cứu đề xuất là chỉ thị DNA [13],[14],[43].
Do số lượng loài Hoàng liên gai trong tự nhiên khan hiếm và ngày càng sụt giảm về số lượng nên việc xây dựng một công cụ phân loại nhanh chóng và chính xác cho loài cây này là một yêu cầu cấp thiết nhằm bảo tồn và phát triển cây Hoàng liên gai tại Việt Nam, chỉ thị DNA barcod là phương pháp phân loại cho kết quả nhanh chóng đã được nhiều nhà khoa học trong và ngoài nước sử dụng trên nhiều đối tượng khác nhau. Vì vậy chúng tôi tiến
hành nghiên cứu xây dựng mã vạch DNA với 5 chỉ thị rpoB, rpoC1, psbA-
trnH, trnL:(nằm trên plasmid phân bố trong lục lạp), ITS ( nằm trong genome
thực vật) để phục vụ cho việc phân loại và nhân dạng cây Hoàng liên gai tại Sa Pa.
Chương II
VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu
- Thực vật : Mẫu hạt, lá cây Hoàng liên gai thu thập tại Vườn Quốc
Gia Hoàng liên - Sa Pa – Lào Cai.
- Chủng Agrobacterium rhizogenes ATCC 15834 do Viện Dược học
và Sinh học phân tử, trường Đại học Heidelberg cung cấp.
2.2. Dụng cụ - hóa chất
- Box cấy vô trùng, các loại thiết bị trong phòng nuôi cấy vô trùng, tủ tối, tủ 370C.
- Dụng cụ nghiên cứu và máy móc thiết bị của Phòng Công nghệ tế
bào thực vật – Viện Công nghệ Sinh học.
- Các muôi trường cơ bản nuôi cấy tế bào thực vật như MS (Murashige and Skoog); YMB (Woody plant medium); LB (Lauria Broth) kháng sinh (cefotaxime, spectinomycine …). Nước cất, javen, ethanol 70o. Ngoài ra còn có các hóa chất thông dụng khác (agar, gellam gum …) của các hãng Sigma, Fermentas, Duchefa.
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Thu thập và nhận dạng loài bằng chỉ thị phân tử.
- Thu thập ngoài thực địa: Dựa vào đặc điểm hình thái, sinh thái của cây Hoàng liên gai và vùng phân bố của chúng, tôi tiến hành thu thập mẫu tại Vườn Quốc gia Hoàng liên - Sa Pa – Lào Cai. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Phương pháp xác định loài bằng chỉ thị DNA: Việc định loài giúp ta tránh việc sử dụng nhầm đối tượng nghiên cứu. Qui trình xác định loài bằng chỉ thị phân tử gồm các bước:
Tách chiết và tinh sạch DNA: Các mẫu lá Hoàng liên gai được tiến hành tách chiết DNA bằng phương pháp CTAB theo Saghai-Maroof et al., 1984 [34].
Tinh sạch và giải trình tự sản phẩm PCR: DNA tổng số sau khi tách chiết thành công được sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR với như sau: bước 1: 94oC, 5 phút; bước 2: 94oC, 30s; bước 3: 54oC, 50s; bước 4: 72oC, 1 phút; từ bước 2 đến bước 4 lặp lại 30 chu kì; bước 5: 72oC, 10 phút; bước 6: 4oC bảo quản mẫu.
Sản phẩm PCR sau đó được điện di trên gel agarose 1% trong đệm 1X
TAE, nhuộm gel trong dung dịch Ethidium brommide và tinh sạch bằng kit
thôi gel của QIAamp. Chúng tôi tiến hành phản ứng PCR với các mồi sau:
Bảng 2.1: Thông tin các mồi sử dụng trong nghiên cứu
STT Tên mồi hiệu Ký Trình tự mồi (5’- 3’)
1 psbA-trnH P10F P10R GTTATGCATGAACGTAATGCTC CGCGCATGGTGGATTCACAATCC
2 ITS P12F ACGAATTCATGGTCCGGTGAAGTGTTCG
P12R TAGAATTCCCCGGTTCGCTCGCCGTTAC
3 rpoB P5F AAGTGCATTGTTGGAACTGG
P5R GATCCCAGCATCACAATTCC
4 rpoC1 P6F P6R GTGGATACACTTCTTGATAATGG CCATAAGCATATCTTGAGTTGG
6 trnL P11F P11R CGAAATCGGTAGACGCTACG GGGGATAGAGGGACTTGAAC
Tách dòng và xác định trình tự gen: Sản phẩm PCR sau tinh sạch được
gắn vào vector tách dòng pBT và biến nạp vào tế bào khả biến E.coli DH5-α theo phương pháp sốc nhiệt của Cohen et al.(1972). Chọn lọc khuẩn lạc
xanh/trắng trên môi trường thạch LB có bổ xung 50mg/l Carbenicilin, 0,004% X-gal và 0,1mM IPTG. Tách plasmid theo hướng dẫn của bộ Kit tách plasmid (Bioneer, Hàn Quốc) và của Sambrook và Russell (2001). Kiểm tra sự có mặt của DNA tái tổ hợp bằng phương pháp clony-PCR với cặp mồi pUC18-F và pUC18-R. Trình tự DNA các đoạn gen rpob, rpoC1, psbA-trnH, trnL, ITS của hai mẫu Hoàng liên gai được xác định bằng máy đọc trình tự tại Phòng Thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Các trình tự được phân tích và so sánh bằng phần mềm BioEdit, DNAstar và dựng cây phát sinh chủng loại trên cơ sở dữ liệu thu được.
2.3.2. Phương pháp khử trùng hạt và đưa mẫu vào nuôi cấy in vitro
Bước 1: Hạt cây Hoàng liên gai được rửa sạch bằng nước xà phòng pha loãng, sau đó xả dưới vòi nước khoảng 10 phút.
Bước 2: Khử trùng hạt với dung dịch C2H5OH 70o trong thời gian từ 1 - 3 phút sau đó rửa lại với nước cất khử trùng 4 - 5 lần ( mỗi lần từ 3 - 4 phút )
Bước 3: Khử trùng hạt với dung dịch HgCl2 0,1% lắc đều trong khoảng thời gian từ 9 - 10 phút rửa lại với nước cất khử trùng 4 - 5 lần ( mỗi lần 3 - 4 phút ).
Bước 4: Đưa hạt ra giấy thấm khử trùng để khô ráo nước, sử dụng panh, dao tách hết lớp vỏ ngoài lấy phôi nhũ. Đưa phôi nhũ vào cấy trong môi trường MS đã chuẩn bị sẵn.
Số mẫu phôi đưa vào cấy 10 - 12 phôi/đĩa. Sau khi cấy xong để trên giá phòng nuôi cấy mô tế bào thực vật với điều kiện chiếu sáng theo quang chu kỳ 16 giờ sáng và 8 giờ tối, nhiệt độ phòng 22 -240C cường độ chiếu sáng 2000 lux. Theo dõi khả năng sinh trưởng phát triển của phôi trên môi trường MS.
2.3.3. Phương pháp chuyển gen thông qua A.rhizogenes
Để thực hiện chuyển gen bằng A.rhizogenes phương pháp chủ yếu tiến hành là lây nhiễm trực tiếp mẫu với dịch huyền phù vi khuẩn trong môi trường lỏng trong một khoảng thời gian nhất định.
Chuẩn bị mẫu mô thực vật: Các mẫu mô thực vật được cắt nhỏ, tạo vết thương trên biểu bì. Các mẫu lá được tạo tổn thương bằng lưỡi dao, cắt bốn cạnh xung quanh. Thân cây Hoàng liên gai cắt nhỏ có chiều dài khoảng 0,3 – 0,4 cm đặt vào trong đĩa petri có sẵn môi trường MS lỏng.
Phương pháp chuyển gen tạo rễ tơ ở cây Hoàng liên gai thông qua vi
khuẩn A.rhizogenes ATCC 15834 bao gồm các bước chính sau:
-Chủng khuần A.rhizogenes ATCC 15834 gốc được cấy ria trên môi trường YMB đặc nuôi trong tủ ấm 28oC trong 48 giờ. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
-Lấy một khuẩn lạc nuôi phục hồi trong trong 20 ml YMB lỏng nuôi
lắc 200 v/p qua đêm .
-Nuôi nhân thu sinh khối: lấy 5 ml dịch khuẩn phục hồi cho vào 45 ml YMB lỏng, nuôi lắc 200 v/p, 28o C trong 4-6 giờ. Các môi trường nuôi khuẩn đều không bổ sung kháng sinh do vector pRi 15834 không có gen kháng kháng sinh.
-Dịch khuẩn được đem ly tâm 6500 v/p ở 4o C thu sinh khối, loại bỏ môi trường nuôi cấy. Cặn khuẩn được hòa tan trong môi trường MS lỏng tạo dịch huyền phù vi khuẩn. Các mẫu thực vật được cắt tạo tổn thương sau đó được lây nhiễm bằng cách ngâm trong dịch huyền phù vi khuẩn .
-Sau khi lây nhiễm, mẫu biến nạp được thấm khô bằng giấy thấm khử
trùng rồi được đặt vào môi trường đồng nuôi cấy: MS + saccharose 30 g/l + agar 8g/l.
-Sau thời gian đồng nuôi cấy, chuyển mẫu lên môi trường diệt khuẩn: MS + saccharose 30 g/l + agar 8g/l + cefotaxime 500 mg/l. Sau 2-4 tuần, các mẫu thực vật bắt đầu cảm ứng tạo rễ và được cắt ra chuyển lên môi trườngMS + saccharose 30 g/l + agar 8g/l + cefotaxime 500 mg/l.
Quy trình tóm tắt tạo rễ tơ ở cây Hoàng liên gai
Hạt cây Hoàng liên gai Chủng vi khuẩn A.Rhizogenes
Khử trùng bằng: C2H5OH ( 70%) Nuôi lỏng tạo huyền phù HgCl2 0,1%
Nảy mầm trên môi trường MS Ly tâm thu sinh khối, tạo huyền phù trong môi trường nhiễm khuẩn 1 tuần
Đoạn thân mầm, lá mầm kích thước 0,5 – 1cm lây nhiễm trong dịch huyền phù vi khuẩn
Đồng nuôi cấy trên MS + AS 50 ở điều kiện tối
2 ngày
Chuyển mô lên môi trường MS ( bổ sung 500ml/l cefotaxim)
2 ngày
Cảm ứng tạo rễ trên môi trường MS ( bổ sung 500ml/l cefotaxim)
1 tháng
Các dòng rễ được cấy chuyển sang từng đĩa petri riêng biệt
Tiếp tục lưu giữ trên môi trường MS đặc Cấy chuyển sang môi trường MS đặc tạo sinh khối
Việc loại bỏ vi khuẩn sau thời gian đồng nuôi cấy là bước quan trọng. Nếu không loại bỏ vi khuẩn thì trong quá trình nuôi cấy rễ tơ, chúng sẽ phát triển trong môi trường nuôi cấy, sẽ tạo cạnh trang nguồn dinh dưỡng gây ảnh hưởng xấu đến khả năng phát triển của rễ tơ tại vị trí nhiễm, thậm trí có thể lấn át không cho rễ phát triển, rễ tơ thường xuất hiện sau khi đã chuyển gen khoảng 3 - 4 tuần.
2.3.4. Kiểm tra hiệu quả chuyển gen thông qua biểu hiện tạm thời gen gus.
Gen gus được khám phá bởi Jefferson [21]. Nó được xem như một công cụ hữu hiệu trong việc đánh giá hoạt động của gen trong cây chuyển gen và được ứng dụng rộng rãi trong lĩnh vực biến nạp gen ở thực vật.
Gen gus (uidA) là một gen chỉ thị lý tưởng với những đặc điểm sau: Sản phẩm của nó là độc nhất và không độc đối với tế bào vật chủ, các enzyme chỉ thị của nó có tính ổn định cao, các phương pháp phân tích sản phẩm của gen này đơn giản, thuận tiện, nhạy và đặc thù.
Cơ chế biểu hiện của gen gus: Gen gus mã hóa cho enzyme β – glucoronidase. Enzyme này là một hydrolase xúc tác cho sự phân giải cơ chất X-Gluc (5-bromo-4-chloro-3-indolyl glucuronide), sản phẩm phân giải có màu xanh đặc trưng dễ nhận biết và rất bền vững. Trong tự nhiên β – glucoronidase không tồn tại trong thực vật, vì vậy gen gus là gen chỉ thị rất hữu hiệu trong kỹ thuật chuyển gen và nhận biết gen chuyển ở thực vật [21].
Để thuận lợi cho việc sử dụng gen chỉ thị gus ở thực vật, người ta tiến hành thiết kế vùng có cấu trúc intron (vùng không phiên mã) có chứa uidA. Do vậy, trong các bước biểu hiện gen gus tạm thời ở mô thực vật tránh được hiện tượng dương tính giả. Khi còn ở trong vi khuẩn Agrobacterium, gen gus
mã để tạo sản phẩm enzyme và không có phản ứng màu đặc trưng khi nhuộm trong cơ chất X-Gluc. Khi được chuyển vào tế bào thực vật, thông qua bộ máy di truyền của tế bào thực vật, gen gus mới được phiên mã, dịch mã để tạo ra sản phẩm tham gia vào phân giải cơ chất và tạo phản ứng màu đặc trưng.
Để đánh giá hiệu quả của một quy trình chuyển gen, người ta thường sử dụng gen chỉ thị gus. Các bộ phận khác nhau của cây chuyển gen được ngâm trong dung dịch đệm cơ chất X-Gluc. Sau 24 - 48 giờ nhuộm mẫu được tẩy hết diệp lục bằng Ethanol và quan sát trên kính núp soi nổi. Biểu hiện hoạt động của gen gus sau khi chuyển vào tế bào thực vật là phản ứng tạo màu đặc trưng trên các tế bào, mô, bộ phận của cây chuyển gen.
Sau khi đồng nuôi cấy, các mẫu thực vật được chuyển lên môi trường diệt khuẩn MS bổ sung cefotaxime 500 mg/l trong 5 – 7 ngày trước khi được nhuộm gus với quy trình được cải tiến theo Jeffeson et al. (1987) [21]. Theo đó, các bộ phận khác nhau của cây chuyển gen được ngâm trong dung dịch đệm cơ chất X-Gluc (Tris/NaCl : 890 µl ; X – Gluc: 100 µl; Triton X – 100 : 10 µl), ủ ở nhiệt độ 370C trong 24 giờ. Sau đó, loại bỏ thuốc nhuộm, ngâm mẫu với ethanol 70% cho đến khi diệp lục mất hoàn toàn.
Cuối cùng, đánh giá sự biểu hiện màu của mẫu nhiễm và chụp ảnh dưới kính hiển vi soi nổi. Biểu hiện hoạt động của gen gus sau khi chuyển vào tế bào thực vật là phản ứng tạo màu đặc trưng trên các tế bào, mô, bộ phận của cây chuyển gen. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Chương III
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Thu thập và nhận dạng loài Hoàng liên gai
3.1.1. Thu thập mẫu
Chúng tôi tiến hành thu các mẫu cây Hoàng liên gai tại các vùng núi thuộc Vườn Quốc Gia Hoàng liên - Sa Pa - Lào Cai dựa trên các đặc điểm hình thái (Cây bụi, cao 2-3m có những cành vươn dài, vỏ thân màu vàng xám nhạt, mỗi đốt dưới chùm lá có gai ba nhánh, dài 1-1,5cm. Lá mọc thành chùm 3 – 4 lá, có khi tới 8 lá ở một đốt. Cuống lá ngắn 0,5 - 1 cm, phiến lá nguyên,