II. NỘI DUNG
3.1.3.Nhận dạng loài bằng chỉ thị DNA
a/ Kết quả tách chiết DNA tổng số
Hình 3.2 là kết quả DNA tổng số được tách chiết từ các mẫu Hoàng liên gai nghiên cứu, dựa trên kết quả thu được trên hình các băng vạch sáng, rõ ràng có thể thấy DNA thu được có chất lượng tốt và sạch.
DNA tổng số của 2 mẫu Hoàng liên gai thu thập được tách chiết theo phương pháp sử dụng CTAB, sau đó các mẫu DNA được dùng để khuếch đại các đoạn gen chỉ thị mong muốn bằng các cặp mồi DNA barcode (bảng 2.1). Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng 5 chỉ thị DNA barcode là ITS, psbA- trnH, trnL, rpoB và rpoC1. Kích thước của các đoạn gen ITS, psbA-trnH, trnL, rpoB và rpoC1 đã nhân bản được tương ứng là 800 bp, 450 bp và 600 bp, 500 bp và 600 bp ở hai mẫu Hoàng liên gai nghiên cứu.
b/ Kết quả nhân dòng, tách dòng và xác định trình tự ở các đoạn gen nghiên cứu
DNA sau khi tách chiết sẽ được dùng làm khuôn để thực hiện phản ứng PCR với các mồi nghiên cứu.
Các mẫu lá sau khi thu thập chúng tôi tiến hành tách chiết theo phương pháp CTAB của Shanghai Maroof và cộng sự (1984). Sau đó được tiến hành điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8%.
Hình 3.5. Kết quả điện di DNA tổng số 8 mẫu trà hoa vàng
Kết quả điện di (hình 3.5) cho thấy các mẫu DNA tổng số phân lập từ các mẫu lá thu được có hàm lượng và chất lượng rất tốt. Các băng vạch DNA đều rất rõ nét.
Hình 3.2. Kết quả khuếch đại và tách dòng đoạn gen ITS từ mẫu Hoàng liên gai. A:. Kết quả tách chiết DNA tổng số; B: Kết quả PCR khuếch đại đoạn
gen ITS từ DNA tổng số các mẫu Hoàng liên gai;C: Kết quả kiểm tra các dòng khuẩn lạcmang đoạn gen ITS.
Kết quả nhân bản đoạn gen ITS (hình 3.2B) cho thấy sử dụng cặp mồi thiết kế đã khuếch đại được đoạn gen ITS có kích thước 800 bp từ DNA của các mẫu Hoàng liên gai. Các đoạn gen này được tinh sạch và biến nạp vào tế bào E. coli DH5α. Hình 3.2C là kết quả kiểm tra các dòng khuẩn lạc đã biến nạp vào E. Coli bằng phản ứng PCR-clony, các dòng khuẩn lạc 1, 2, 3, 6, 9, 11 là những dòng khuẩn lạc âm tính không mang gen tái tổ hợp, những dòng khuẩn lạc còn lại là những dòng có chứa đoạn gen tái tổ hợp sẽ được tiến
A B C
hành nuôi qua đêm trong môi trường LB lỏng có bổ sung 50mg/l Carbenicilin, sau đó tách plasmid và gửi 01 dòng/mẫu đọc trình tự.
Kết quả phân tích trình tự
Trình tự gen rpoB và trnL của chi Berberis trên Genbank là rất hạn chế. Ở đoạn gen rpoB chúng tôi chỉ tìm thấy trình tự của loài Berberis bealei. Với gen trnL có 3 trình tự của chi Berberis được đăng tải là Berberis bealei, Berberis vulgaris và Berberis thunbergii. Kết quả phân tích sự khác nhau giữa các cặp loài theo mô hình Kimura 2P cho thấy:
Ở chỉ thị rpoB mức độ sai khác thấp nhất được tìm thấy giữa các cặp loài thuộc cùng một chilà (1%) được tìm thấy ở (HLGQD và HLGQX, HLGQD và Berberis bealei) mức độ sai khác này cũng tìm thấy ở 2 loài
Magnolia grandiflora và Liriodendron tulipifera. Sự sai khác lớn nhất là 10% được tìm thấy ở 2 loài Magnolia grandiflora và Ranunculus macranthus.
Bảng 3.5. Bảng hệ số sai khác xây dựng trên trình tự nucleotit của gen trnL
Kết quả phân tích sự sai khác của các trình tự theo mô hình Kimura 2P (Bảng 3.5) của chỉ thị trnL cho thấy sự sai khác nhỏ nhất (0%) được tìm thấy giữa hai loài trong chi Berberis là ở loài Berberis vulgais và Berberis bealei,
mức độ sai khác lớn nhất trong chi Berberis được tìm thấy ở 2 loài Hoàng liên gai Sa Pa và loài Berberis thunbergii có nguồn gốc từ Nhật Bản. Mức độ sai khác giữa chi Berberisvới 2 chi Caulophyllum và Myristica là từ 9 – 16%.
Cây phân loại xây dựng trên cơ sở chỉ thị trnL (Hình 3.3) cho thấy các loài thuộc chi Berberis thuộc nhóm phân loại gần gũi với nhau phân biệt với 2 chi Caulophyllum và Myristica độ tin cậy 100%. Hai loài HLGQD và HLGQX phân biệt với 3 loài khác thuộc chi Berberis với độ tin cậy 96%. Có thể thấy rằng chỉ thị trnL vừa cho phép phân biệt 2 loài Hoàng liên gai tại Sa Pa với các loài Hoàng liên gai khác, đồng thời có khả năng phân biệt chi
Berberis với các chi khác với độ tin cậy 100%. Cả hai chỉ thị này hứa hẹn sẽ là một công cụ phân loại chính xác và hiểu quả các loài Hoàng liên gai khi mà nó vừa cho phép xác định rõ các chi khác nhau lại vừa có thể nhận biết rõ ràng các loài trong cùng chi Berberis. Tuy nhiên sự kết hợp với các chỉ thị khác là điều cần thiết khi mà số lượng các loài thuộc chi Berberisở chỉ thị này được tìm thấy trên Genbank là rất hạn chế.
Hình 3.3. Cây phân loại xây dựng theo phương pháp NJ (Neighbor-Joining) của chỉ thị trnL
Với 3 chỉ thị còn lại là rpoC1, psbA-trnH, ITS số lượng trình tự các loài thuộc chi Berberis được tìm thấy trên Genbank từ 11 đến hơn 20 loài, kết quả so sánh trình tự ban đầu cũng cho thấy rằng tất cả những mẫu HLGQD và HLGQX có trình tự giống nhau 100% ở cả 3 chỉ thị. Điều này giúp nhận định những mẫu Hoàng liên gai có cùng hình thái tại Sa Pa là cùng thuộc một loài càng trở nên tin cậy hơn.
Tiến hành so sánh trình tự gen rpoC1 của các mẫu Hoàng liên gai thu tại Sa Pa với 11 trình tự tương đồng của các loài Berberis trên Genbank. Mức độ sai khác của được phân tích theo mô hình Kimura 2P. Kết quả cho thấy mức độ sai khác nhỏ nhất (0%)được tìm thấy ở hầu hết các loài thuộc chi Berberis.
ở loài HLGQD với Berberis thunbergi và một số cặp khác. Điều này cho thấy mức độ bảo thủ loài ở chi Berberis là rất cao. Mức độ sai khác lớn nhất được tìm thấy là 5% ở loài Berberis thunbergi với các chi Trochodendron, Nelumbo, Megaleranthis.
Với gen psbA-trnH chúng tôi tìm thấy trình tự của của18 loài Berberis
trên Genbank. Tiến hành phân tích sự khác nhau của các mẫu Hoàng liên gai nghiên cứu với 18 loài Berberis này theo mô hình Kimura 2P nhận thấy, mức độ sai khác nhỏ nhất là 0% được tìm thấy ở 2 loài HLGQD với HLGQX, HLGQD vớiBerberis kwakamivà một số loài Berberis khác. Mức độ sai khác lớn nhất 3% tìm thấy ở loài HLGQD với Berberis mycrophylla, Berberis valdiviana, Berberis kwakami cùng với một số cặp khác. Sự sai khác này có thể lí giải bởi việc cách ly địa lí khi mà loài những loài có mức độ sai khác lớn với 2 mẫu nghiên cứu như Berberis mycrophylla, Berberis valdiviana là những loài được tìm thấy chủ yếu ở châu Mĩ, còn những loài có mức độ sai khác thấp như Berberis kwakami được tìm thấy ở Đài Loan gần với Việt Nam.
Cây phân loại xây dựng trên trình tự của gen rpoC1 cho thấy 2 loài hoàng liên gai thu tại Sa Pa thuộc cùng một nhóm phân loại với 2 loài Hoàng liên gai khác là Berberis bergmanniae và Berberis candidula đồng thời phân biệt với các loài Hoàng liên gai khác cũng như phân biệt chi Berberis với các chi khác như Nandina, Trochodendron. Tuy nhiên chỉ thị này không cho phép phân biệt một số loài của chi Berberisnhu Berberis sieboldii với Berberis zabeliana hayBerberis amurensis với Berberis bealei và một số loài Berberis
với nhau.
Tương tự như ở chỉ thị rpoC1, cây phân loại được xây dựng bởi trình tự nucleotide của chỉ thị psbA-trnH có thể chia cây phân loại ra làm 2 nhánh lớn (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
với bootstrap là 84%. Trong đó 2 mẫu Hoàng liên gai Sa Pa thuộc chung nhóm phân loại với Berberis kwakami và Berberis candidula và phân biệt với các loài khác trong chi Berberis với chỉ số bootstrap là 93%. Chỉ thị psbA- trnH không cho phép phân biết 2 loài Hoàng liên ga Sa Pa với nhau và với 2 loài Berberis kwakami, Berberis candidula. Tương tự chỉ thị rpoC1, chỉ thị này cũng không thể phân biệt một số loài Berberis với nhau như loài Berberis bergmanniae với Berberis pruinoisa, Berberis dumicola và một số loài khác. Hình ảnh cây phân loại của 2 chỉ thị này không được trình bày ở đây.
Chỉ thị ITS là một trong những chỉ thị được sử dụng phổ biến trong các nghiên cứu barcode vì chỉ thị này có tính bảo thủ cao trong loài đồng thời có sự sai khác cao giữa các loài khác nhau, đoạn gen ITS nằm ở vùng 5,8S trong nhân. Tiến hành so sánh trình tự đoạn gen ITS của 2 mẫu Hoàng liên gai Sa Pa với 25 trình tự khác trên ngân hàng Genbank theo mô hình Kimura 2P, kết quả cho thấy mức độ sai khác nhỏ nhất trong chi Berberis là (0%) ở 10 mẫu Hoàng liên gai nghiên cứu và các loài Berberistsiennii, Berberisgriffithinan,
Berberisinsignis và Berberisreplicata có độ tương đồng, ngoài ra một số loài khác như Berberisbidentata và Berberisdarwinii, Berberismycophilla cũng có mức độ sai khác 0%. Mức độ sai khác lớn nhất là (4%) ở loài Berberis fortune
với loài HLGQD, HLGQX và một số loài Hoàng liên gai khác.
Cây phân loại xây dựng dựa theo trình tự nucleotide của chỉ thị ITS
(Hình 3.3) cho thấy 2 loài Hoàng liên gai nghiên cứu thuộc cùng một nhóm phân loại cùng với các loài Berberis tsiennii, Berberis griffithinan, Berberis insignis và Berberis replicata đồng thời phân biệt với các loài khác trong chi
Berberis với chỉ số bootstrap là 87. Loài Berberis fortune tạo thành một nhánh phân loại riêng biệt so với các loài còn lại của chi Berberis. Mặc dù chỉ thị này cho phép phân biệt 2 loài Hoàng liên gai nghiên cứu với nhiều loài thuộc chi Berberis nhưng nó không cho phép phân biệt được một số loài với
nhau như Berberismicophylla với Berberis empetrfolia, Berberis comberia
hay Berberis ilicifolia với Berberis serato-dental.
Hình 3.4. Cây phân loại xây dựng theo phương pháp NJ (Neighbor-Joining) của chỉ thị ITS.
Như vậy, chúng tôi đã xác định được trình tự nucleotide của 5 chỉ thị
wallichiana DC.1824 và Berberis julianae Schneid.1913 (Phụ lục 2) thu tại Sa Pa và đăng ký các trình tự trên Ngân hàng Genebank (bảng 3.2). Kết quả này góp phần cung cấp thêm cho sự đa dạng trình tự của các loài Hoàng liên gai trên hệ thống cơ sở dữ liệu của Genebank.
Xây dựng và phân tích cây phân loại dựa vào các trình tự nucleotide của các chỉ thị trên cho thấy: Sử dụng 3 chỉ thị ITS, psbA-trnH, rpoC1 cho phép phân biệt 2 loài Hoàng liên gai với nhiều loài khác thuộc chi Berberis nhưng không thể phân biệt 2 loài Hoàng liên gai tại Sa Pa với nhau; chỉ thị trnL và
rpoB cho phép phân biệt 2 loài Hoàng liên gai tại Sa Pa nhưng số lượng loài thuộc chi Berberis sử dụng trong phân tích này rất ít. Do vậy kiến nghị sử dụng kết hợp hai chỉ thị ITS và trnL để có một công cụ phân loại chính xác.
Qua đó, chúng tôi đã xác định được trình tự 2 mẫu Hoàng liên gai
Barberis wallichiana DC.1824 và Berberis julianae Schneid.1913 kí hiệu là HLG1 và HLG2 thu tại Sa Pa với 5 chỉ thị rpob, rpoC1, psbA-trnH, trnL và
ITS. Dựa vào kết quả thu được, chúng tôi đã sử dụng loài HLG2 Berberis julianae Schneid.1913 làm đối tượng nghiên cứu. Chỉ thị trnL cho phép phân biệt hai mẫu Hoàng liên gai Sa Pa so với các loài Hoàng liên gai khác.