II. NỘI DUNG
2.3.3. Phương pháp chuyển gen thông qua A.rhizogenes
Để thực hiện chuyển gen bằng A.rhizogenes phương pháp chủ yếu tiến hành là lây nhiễm trực tiếp mẫu với dịch huyền phù vi khuẩn trong môi trường lỏng trong một khoảng thời gian nhất định.
Chuẩn bị mẫu mô thực vật: Các mẫu mô thực vật được cắt nhỏ, tạo vết thương trên biểu bì. Các mẫu lá được tạo tổn thương bằng lưỡi dao, cắt bốn cạnh xung quanh. Thân cây Hoàng liên gai cắt nhỏ có chiều dài khoảng 0,3 – 0,4 cm đặt vào trong đĩa petri có sẵn môi trường MS lỏng.
Phương pháp chuyển gen tạo rễ tơ ở cây Hoàng liên gai thông qua vi
khuẩn A.rhizogenes ATCC 15834 bao gồm các bước chính sau:
-Chủng khuần A.rhizogenes ATCC 15834 gốc được cấy ria trên môi trường YMB đặc nuôi trong tủ ấm 28oC trong 48 giờ.
-Lấy một khuẩn lạc nuôi phục hồi trong trong 20 ml YMB lỏng nuôi
lắc 200 v/p qua đêm .
-Nuôi nhân thu sinh khối: lấy 5 ml dịch khuẩn phục hồi cho vào 45 ml YMB lỏng, nuôi lắc 200 v/p, 28o C trong 4-6 giờ. Các môi trường nuôi khuẩn đều không bổ sung kháng sinh do vector pRi 15834 không có gen kháng kháng sinh.
-Dịch khuẩn được đem ly tâm 6500 v/p ở 4o C thu sinh khối, loại bỏ môi trường nuôi cấy. Cặn khuẩn được hòa tan trong môi trường MS lỏng tạo dịch huyền phù vi khuẩn. Các mẫu thực vật được cắt tạo tổn thương sau đó được lây nhiễm bằng cách ngâm trong dịch huyền phù vi khuẩn .
-Sau khi lây nhiễm, mẫu biến nạp được thấm khô bằng giấy thấm khử
trùng rồi được đặt vào môi trường đồng nuôi cấy: MS + saccharose 30 g/l + agar 8g/l.
-Sau thời gian đồng nuôi cấy, chuyển mẫu lên môi trường diệt khuẩn: MS + saccharose 30 g/l + agar 8g/l + cefotaxime 500 mg/l. Sau 2-4 tuần, các mẫu thực vật bắt đầu cảm ứng tạo rễ và được cắt ra chuyển lên môi trườngMS + saccharose 30 g/l + agar 8g/l + cefotaxime 500 mg/l.
Quy trình tóm tắt tạo rễ tơ ở cây Hoàng liên gai
Hạt cây Hoàng liên gai Chủng vi khuẩn A.Rhizogenes
Khử trùng bằng: C2H5OH ( 70%) Nuôi lỏng tạo huyền phù HgCl2 0,1%
Nảy mầm trên môi trường MS Ly tâm thu sinh khối, tạo huyền phù trong môi trường nhiễm khuẩn 1 tuần
Đoạn thân mầm, lá mầm kích thước 0,5 – 1cm lây nhiễm trong dịch huyền phù vi khuẩn
Đồng nuôi cấy trên MS + AS 50 ở điều kiện tối
2 ngày
Chuyển mô lên môi trường MS ( bổ sung 500ml/l cefotaxim)
2 ngày
Cảm ứng tạo rễ trên môi trường MS ( bổ sung 500ml/l cefotaxim)
1 tháng
Các dòng rễ được cấy chuyển sang từng đĩa petri riêng biệt
Tiếp tục lưu giữ trên môi trường MS đặc Cấy chuyển sang môi trường MS đặc tạo sinh khối
Việc loại bỏ vi khuẩn sau thời gian đồng nuôi cấy là bước quan trọng. Nếu không loại bỏ vi khuẩn thì trong quá trình nuôi cấy rễ tơ, chúng sẽ phát triển trong môi trường nuôi cấy, sẽ tạo cạnh trang nguồn dinh dưỡng gây ảnh hưởng xấu đến khả năng phát triển của rễ tơ tại vị trí nhiễm, thậm trí có thể lấn át không cho rễ phát triển, rễ tơ thường xuất hiện sau khi đã chuyển gen khoảng 3 - 4 tuần.
2.3.4. Kiểm tra hiệu quả chuyển gen thông qua biểu hiện tạm thời gen gus.
Gen gus được khám phá bởi Jefferson [21]. Nó được xem như một công cụ hữu hiệu trong việc đánh giá hoạt động của gen trong cây chuyển gen và được ứng dụng rộng rãi trong lĩnh vực biến nạp gen ở thực vật.
Gen gus (uidA) là một gen chỉ thị lý tưởng với những đặc điểm sau: Sản phẩm của nó là độc nhất và không độc đối với tế bào vật chủ, các enzyme chỉ thị của nó có tính ổn định cao, các phương pháp phân tích sản phẩm của gen này đơn giản, thuận tiện, nhạy và đặc thù.
Cơ chế biểu hiện của gen gus: Gen gus mã hóa cho enzyme β – glucoronidase. Enzyme này là một hydrolase xúc tác cho sự phân giải cơ chất X-Gluc (5-bromo-4-chloro-3-indolyl glucuronide), sản phẩm phân giải có màu xanh đặc trưng dễ nhận biết và rất bền vững. Trong tự nhiên β – glucoronidase không tồn tại trong thực vật, vì vậy gen gus là gen chỉ thị rất hữu hiệu trong kỹ thuật chuyển gen và nhận biết gen chuyển ở thực vật [21].
Để thuận lợi cho việc sử dụng gen chỉ thị gus ở thực vật, người ta tiến hành thiết kế vùng có cấu trúc intron (vùng không phiên mã) có chứa uidA. Do vậy, trong các bước biểu hiện gen gus tạm thời ở mô thực vật tránh được hiện tượng dương tính giả. Khi còn ở trong vi khuẩn Agrobacterium, gen gus
mã để tạo sản phẩm enzyme và không có phản ứng màu đặc trưng khi nhuộm trong cơ chất X-Gluc. Khi được chuyển vào tế bào thực vật, thông qua bộ máy di truyền của tế bào thực vật, gen gus mới được phiên mã, dịch mã để tạo ra sản phẩm tham gia vào phân giải cơ chất và tạo phản ứng màu đặc trưng.
Để đánh giá hiệu quả của một quy trình chuyển gen, người ta thường sử dụng gen chỉ thị gus. Các bộ phận khác nhau của cây chuyển gen được ngâm trong dung dịch đệm cơ chất X-Gluc. Sau 24 - 48 giờ nhuộm mẫu được tẩy hết diệp lục bằng Ethanol và quan sát trên kính núp soi nổi. Biểu hiện hoạt động của gen gus sau khi chuyển vào tế bào thực vật là phản ứng tạo màu đặc trưng trên các tế bào, mô, bộ phận của cây chuyển gen.
Sau khi đồng nuôi cấy, các mẫu thực vật được chuyển lên môi trường diệt khuẩn MS bổ sung cefotaxime 500 mg/l trong 5 – 7 ngày trước khi được nhuộm gus với quy trình được cải tiến theo Jeffeson et al. (1987) [21]. Theo đó, các bộ phận khác nhau của cây chuyển gen được ngâm trong dung dịch đệm cơ chất X-Gluc (Tris/NaCl : 890 µl ; X – Gluc: 100 µl; Triton X – 100 : 10 µl), ủ ở nhiệt độ 370C trong 24 giờ. Sau đó, loại bỏ thuốc nhuộm, ngâm mẫu với ethanol 70% cho đến khi diệp lục mất hoàn toàn.
Cuối cùng, đánh giá sự biểu hiện màu của mẫu nhiễm và chụp ảnh dưới kính hiển vi soi nổi. Biểu hiện hoạt động của gen gus sau khi chuyển vào tế bào thực vật là phản ứng tạo màu đặc trưng trên các tế bào, mô, bộ phận của cây chuyển gen.
Chương III
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Thu thập và nhận dạng loài Hoàng liên gai
3.1.1. Thu thập mẫu
Chúng tôi tiến hành thu các mẫu cây Hoàng liên gai tại các vùng núi thuộc Vườn Quốc Gia Hoàng liên - Sa Pa - Lào Cai dựa trên các đặc điểm hình thái (Cây bụi, cao 2-3m có những cành vươn dài, vỏ thân màu vàng xám nhạt, mỗi đốt dưới chùm lá có gai ba nhánh, dài 1-1,5cm. Lá mọc thành chùm 3 – 4 lá, có khi tới 8 lá ở một đốt. Cuống lá ngắn 0,5 - 1 cm, phiến lá nguyên, hình mác, mép có răng cưa to, cứng, dài 16-17cm, rộng 4-6cm, mặt trên màu xanh lục nhạt, mặt dưới màu trắng..).
Trong quá trình thu thập mẫu, chúng tôi thu thập được hai mẫu Hoàng liên gai có đặc điểm hình thái khác nhau tại Vườn Quốc Gia Hoàng liên. Chúng tôi tiến hành nhận bước đầu qua đặc điểm hình thái của hai loài Hoàng liên gai thu nhận được.
Các mẫu Hoàng liên gai thu tại Sa Pa, thông tin các mẫu được liệt kê ở
bảng 3.1
Bảng 3.1. Thông tin và kí hiệu mẫu Hoàng liên gai thu thập tại Sa Pa
STT Kí hiệu mẫu Nguồn gốc
1 HLGQD1 Berberis wallichiana DC
2 HLGQD2 Berberis wallichiana DC
3 HLGQD3 Berberis wallichiana DC
4 HLGQD4 Berberis wallichiana DC
5 HLGQD5 Berberis wallichiana DC
STT Kí hiệu mẫu Nguồn gốc
7 HLGQX2 Berberis julianae Schneid
8 HLGQX3 Berberis julianae Schneid
9 HLGQX4 Berberis julianae Schneid
10 HLGQX5 Berberis julianae Schneid
Các trình tự nucleotide các đoạn gen Hoàng liên gai khai thác trên Genbank (phụ lục 2).
Chúng tôi xác định được trình tự của 2 loài Hoàng liên gai thu tại Sa Pa với 5 chỉ thị barcode, các trình tự này đã được đăng ký trên Genbank, thông tin các trình tự này được thống kê tại bảng 3.2.
Bảng 3.2. Thông tin các trình tự của 2 loài Hoàng liên gai nghiên cứu đăng ký trên Genbank
STT Tên mẫu Đoạn gen Mã số trên Genbank
1 Berberis wallichiana DC ITS KM580591 2 Berberis wallichiana DC psbA-trnH KM580592 3 Berberis wallichiana DC rpoB KM580595 4 Berberis wallichiana DC rpoC1 KM580593 5 Berberis wallichiana DC trnL KM580594
6 Berberis julianae Schneid ITS KM580586
7 Berberis julianae Schneid psbA-trnH KM580587
8 Berberis julianae Schneid rpoB KM580588
9 Berberis julianae Schneid rpoC1 KM580589
3.1.2. Nhậndạng loài bằng so sánh hình thái
Qua so sánh hình thái cũng như kinh nghiệm dân gian, chúng tôi nhận thấy hai loài Hoàng liên gai có đặc điểm hình thái khác biệt rõ rệt, có tên gọi khác nhau là Hoàng liên gai và Hoàng liên ba gai. Bên cạnh đó, theo khóa phân loại theo hình thái, tên khoa học của hai loài này cũng khác nhau: Hoàng liên gai có tên khoa học là Berberis julianae Schneid. 1913 trong khi Hoàng liên ba gai có tên khoa học là Berberis wallichiana DC. 1824. Đặc điểm hình thái của hai loài được thể hiện ở bảng 3.3.
Hình 3.1:Hai loài Hoàng liên thu thập tại Vườn Quốc gia Hoàng liên. a)Cây Hoàng liên gai Berberis julianae Schneid. 1913. b) Hoàng liên ba gai Barberis
wallichiana DC.1824.
Bảng 3.3: Đặc điểm hình thái hai loài Hoàng liên tại Sa pa - Lào Cai HOÀNG LIÊN GAI
Berberis julianae Schneid. 1913. Họ: Hoàng mộc Berberidaceae
Bộ: Mao lương Ranunculales
HOÀNG LIÊN BA GAI
Berberis wallichiana DC. 1824. Họ: Hoàng mộc Berberidaceae
Bộ: Mao lương Ranunculales
Đặc điểm nhận dạng:
Thân
Cây bụi, cao 2 – 3 m. Thân và rễ có màu vàng đậm, phân cành nhiều; cành vươn có lóng dài.
Cây bụi, cao 2 – 3 m. Thân và rễ có màu vàng đậm, phân cành dài; cành vươn có lóng dài.
Lá
Lá mọc vòng 3 - 7 lá, gần như không cuống; phiến lá thuôn nhọn 2 đầu, dài, cứng, hơi bóng ở mặt trên.
Kích thước lá lớn hơn Hoàng liên ba gai. Kích thước lá Hoàng liên gai từ 3,5 – 10 cm x 1,5 – 2 cm, mép lá có răng cưa nhỏ, đều và nhọn.
Đặc biệt Hoàng liên gai có các gai đơn mọc dưới các túm lá.
Lá mọc vòng 3 – 5 lá, gần như
không cuống; phiến lá hình
thuôn, ngắn, cứng, bóng ở mặt trên.
Kích thước lá ngắn hơn so với Hoàng liên gai. Kích thước lá Hoàng liên ba gai vào khoảng 3 – 9 cm x 1,2 - 2,5 cm, mép khía răng cưa đều, nhọn sắc
Hoàng liên ba gai có gai nhạnh 3 nhánh, mọc dưới các túm lá.
Hoa
Hoa nhiều, gồm 10 – 30 bông
mọc ở giữa các túm lá. Hoa nhỏ, có cuống dài 1 - 1,3 cm, màu vàng, hình trứng ngược xếp thành 2 vòng. Cánh hoa nhỏ hơn đài, hình trứng thuôn, đỉnh lõm, gốc có 2 tuyến nhầy.
Hoa nhiều, gồm 6 – 20 bông
mọc giữa các túm lá. Hoa nhỏ, có cuống dài 1,5 – 2 cm, hoa màu vàng chanh, hình trứng. Cánh hoa, hình thìa, có kích thước bằng nhau và dài hơn đài, mỗi cánh hoa có 2 tuyến nhầy.
Quả
Quả hình trứng thuôn, dài 0,5 cm; đầu nhuỵ tồn tại rõ; quả màu xanh khi chín chuyển màu xanh hơi đen tại đầu nhụy.
Quả thuôn, dài 0,6 – 0,7 cm; đầu nhuỵ tồn tại rõ, quả có màu nâu đỏ khi chín màu tím đen.
Sinh học và sinh thái:
Mùa hoa tháng 3-4 quả tháng 4-10 (11). Khối lượng 1.000 hạt: 20,12 gam; tỷ lệ nảy mầm của hạt khi gieo 38,1%; thời gian nảy mầm từ 38 – 60 ngày. Cây con mọc từ hạt trong tự nhiên quan sát được vào tháng 4 và 5. Có khả năng tái sinh sau khi bị chặt phát. Cây ưa ẩm, chịu bóng khi còn nhỏ, sau ưa sáng; thích nghi với vùng có khí hậu á nhiệt đới núi cao. Thường mọc rải rác ở rừng cây bụi leo núi đá vôi, ở độ cao 1500-1600 m.
Phân bố:
Phân bố chủ yếu tại các vùng núi tỉnh Lào Cai (Sapa: núi Hàm Rồng; Bát Xát).
Qua so sánh đặc điểm hình thái, chúng tôi nhận thấy một số đặc điểm khác biệt rõ rệt có thể sử dụng làm đặc điểm nhận dạng hai loài Hoàng liên này. Các đặc điểm khác biệt được thể hiện ở bảng 3.4.
Bảng 3.4: Đặc điểm phân biệt hai loài Hoàng liên Đặc điểm
nhận dạng
HOÀNG LIÊN GAI
Berberis julianae Schneid. 1913
HOÀNG LIÊN BA GAI
Berberis wallichiana DC. 1824
Lá Lá hình thuôn, dai. Có gai đơn dưới các cụm lá Lá hình thuôn ngắn. Có gai 3 ngạnh dưới các cụm lá
Hoa Nhiều hoa trên một cụm hoa Số lượng hoa trên cụm hoa ít hơn
Quả Quả có màu xanh tím khi chín Quả có màu đỏ hơi tím khi chín
3.1.3. Nhận dạng loài bằng chỉ thị DNA
a/ Kết quả tách chiết DNA tổng số
Hình 3.2 là kết quả DNA tổng số được tách chiết từ các mẫu Hoàng liên gai nghiên cứu, dựa trên kết quả thu được trên hình các băng vạch sáng, rõ ràng có thể thấy DNA thu được có chất lượng tốt và sạch.
DNA tổng số của 2 mẫu Hoàng liên gai thu thập được tách chiết theo phương pháp sử dụng CTAB, sau đó các mẫu DNA được dùng để khuếch đại các đoạn gen chỉ thị mong muốn bằng các cặp mồi DNA barcode (bảng 2.1). Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng 5 chỉ thị DNA barcode là ITS, psbA- trnH, trnL, rpoB và rpoC1. Kích thước của các đoạn gen ITS, psbA-trnH, trnL, rpoB và rpoC1 đã nhân bản được tương ứng là 800 bp, 450 bp và 600 bp, 500 bp và 600 bp ở hai mẫu Hoàng liên gai nghiên cứu.
b/ Kết quả nhân dòng, tách dòng và xác định trình tự ở các đoạn gen nghiên cứu
DNA sau khi tách chiết sẽ được dùng làm khuôn để thực hiện phản ứng PCR với các mồi nghiên cứu.
Các mẫu lá sau khi thu thập chúng tôi tiến hành tách chiết theo phương pháp CTAB của Shanghai Maroof và cộng sự (1984). Sau đó được tiến hành điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8%.
Hình 3.5. Kết quả điện di DNA tổng số 8 mẫu trà hoa vàng
Kết quả điện di (hình 3.5) cho thấy các mẫu DNA tổng số phân lập từ các mẫu lá thu được có hàm lượng và chất lượng rất tốt. Các băng vạch DNA đều rất rõ nét.
Hình 3.2. Kết quả khuếch đại và tách dòng đoạn gen ITS từ mẫu Hoàng liên gai. A:. Kết quả tách chiết DNA tổng số; B: Kết quả PCR khuếch đại đoạn
gen ITS từ DNA tổng số các mẫu Hoàng liên gai;C: Kết quả kiểm tra các dòng khuẩn lạcmang đoạn gen ITS.
Kết quả nhân bản đoạn gen ITS (hình 3.2B) cho thấy sử dụng cặp mồi thiết kế đã khuếch đại được đoạn gen ITS có kích thước 800 bp từ DNA của các mẫu Hoàng liên gai. Các đoạn gen này được tinh sạch và biến nạp vào tế bào E. coli DH5α. Hình 3.2C là kết quả kiểm tra các dòng khuẩn lạc đã biến nạp vào E. Coli bằng phản ứng PCR-clony, các dòng khuẩn lạc 1, 2, 3, 6, 9, 11 là những dòng khuẩn lạc âm tính không mang gen tái tổ hợp, những dòng khuẩn lạc còn lại là những dòng có chứa đoạn gen tái tổ hợp sẽ được tiến
A B C
hành nuôi qua đêm trong môi trường LB lỏng có bổ sung 50mg/l Carbenicilin, sau đó tách plasmid và gửi 01 dòng/mẫu đọc trình tự.
Kết quả phân tích trình tự
Trình tự gen rpoB và trnL của chi Berberis trên Genbank là rất hạn chế. Ở đoạn gen rpoB chúng tôi chỉ tìm thấy trình tự của loài Berberis bealei. Với gen trnL có 3 trình tự của chi Berberis được đăng tải là Berberis bealei, Berberis vulgaris và Berberis thunbergii. Kết quả phân tích sự khác nhau giữa các cặp loài theo mô hình Kimura 2P cho thấy:
Ở chỉ thị rpoB mức độ sai khác thấp nhất được tìm thấy giữa các cặp loài thuộc cùng một chilà (1%) được tìm thấy ở (HLGQD và HLGQX, HLGQD và Berberis bealei) mức độ sai khác này cũng tìm thấy ở 2 loài