II. NỘI DUNG
1.2.4.Nuôi cấy sinh khối rễ tơ
Rễ tơ là tên gọi dùng để chỉ các rễ bất định được sản sinh ra mạnh mẽ tại vị trí bị nhiễm bởi vi khuẩn A.rhizogenes. T-DNA từ A.rhizogenes sau khi chuyển vào tế bào thực vật thì chúng sẽ được gắn vào bộ gen của thực vật, từ đó tế bào thực vật sẽ làm nhiệm vụ biểu hiện các gen rol và gen aux ( tổng hợp ra các IAA) làm tăng khả năng tạo các lông rễ một cách mạnh mẽ ngay tại vị trí bị tổn thương ở mô thực vật đó. Số lượng các lông rễ được tạo ra khá nhiều, phát triển thành một hệ thống lông rễ, hay còn gọi là hệ thống rễ tơ [36].
Hình 1.5. Các hệ rễ tơ được nuôi cấy
1. Rễ tơ Beta vulgaris phát triển trên môi trường agar 2. Rễ tơ của cây đậu phộng (Arachis hypogaea) 3. Rễ tơ G. glabra nuôi trong môi trường lỏng
4. Nuôi cấy rễ tơ G.glabra bằng hệ thống bioreactor (a); thu hoạch sinh khối rễ sau 30 ngày nuôi cấy (b,c)
Điểm đặc trưng nổi bật của hệ thống tễ tơ là chúng có khả năng phát triển nhanh và ổn định trên môi trường nuôi cấy không cần bổ sung chất điều hòa sinh trưởng thực vật, với sự chuyển gen của A. rhizogenes vào tế bào rễ tơ có khả năng tổng hợp ra nhiều loại hợp chất tự nhiên với hiệu suất cao mà các tế bào không phân hóa và các rễ bất định không chuyển gen không tổng hợp được hay tổng hợp với hàm lượng không đáng kể [36].
Ứng dụng của nuôi cấy sinh khối rễ tơ
Công nghệ nuôi cấy rễ tơ đã và đang được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực nhờ vào những ưu điểm của mình. Rễ chuyển gen có đặc tính là tốc độ sinh trưởng nhanh và tính di truyền ổn định. Rễ tơ có thể sản xuất một lượng lớn hợp chất thứ cấp hay hàng loạt hợp chất có liên quan tới thực vật.
Sản xuất hợp chất thứ cấp
Thông thường, nuôi cấy rễ cần có sự xuất hiện của các chất điều hòa sinh trưởng ngoại sinh, hay là sự có mặt của các chất này trong môi trường nuôi cấy. Phương pháp nuôi cấy rễ này tạo các dòng rễ sinh trưởng rất chậm và có thể dẫn đến tình trạng thiếu hụt hay tổng hợp kém các hoạt chất thứ cấp. Tuy nhiên, rễ tơ đã cải tiến công nghệ nuôi cấy tế bào thực vật trong thu nhận các hợp chất có giá trị sinh học cao. Rễ tơ cũng đã cung cấp một nguồn hóa chất thiên nhiên dồi dào cho các ngành công nghiệp dược phẩm, hóa mỹ phẩm và phụ gia thực phẩm [9].
Kim và cs (2009) đã sử dụng 3 chủng A.rhizogenes là R1000, A4 và ATCC 15834 cảm ứng với loài Taxus cuspidata và thu nhận được 107 dòng rễ tơ. Trải qua quá trình sàng lọc cho 3 dòng rễ tơ có thể sinh trưởng tốt trên môi trường MS không chất điều hòa sinh trưởng, và có khả năng sinh tổng hợp taxol - một hợp chất có công dụng mạnh trong điều trị ung thư [22].
Bảng 1.1: Một số loài thực vật được nuôi cấy rễ tơ để thu hoạt chất sinh học[19].
Cây chủ Hoạt chất thứ cấp
Artemisia annua Artemisinin
Panax ginseng Saponin
Panax hybird Ginsenosides
Taxus cuspidata Taxus
Rễ tơ được xem như là muột nguồn nguyên liệu có giá trị trong sản xuất các hợp chất tự nhiên có lợi như dược phẩm, các chất phụ gia trong ngành mỹ phẩm và thực phẩm. Vào năm 2002, Sevon đã tổng kết lại những hợp chất ankaloid quan trọng nhất trong ngành được sản xuất bởi hệ thống rễ tơ, bao gồm A.tropabelladonna L., Catharanthus tricophyllus L., và Datura củadida L [36]. Nhờ vào những đặc điểm như phát triển nhanh, dễ duy trì ổn định và khả năng tổng hợp một số lượng lớn hợp chất tự nhiên, hệ thống rễ tơ thể hiện tiềm năng lớn trong việc sản xuất các hợp chất tự nhiên thông qua các hệ thống nuôi cấy liên tục. Điều này có ý nghĩa lớn trong việc sản xuất các sản phẩm hợp chất tự nhiên trên quy mô công nghiệp với hiệu xuất cao, giảm chi phí trong quá trình sản xuất từ đó giảm giá thành sản phẩm.
Bên cạnh việc chuyển T-DNA của A.rhizogenes vào tế bào thì ta có thể chuyển các gen ngoại lai vào trong tế bào thông qua việc tái tổ hợp đoạn gen đó vào trong đoạn T-DNA của A.rhizogenes. Các gen này có thể là gen biểu hiện ra các hợp chất mục tiêu hay có thể là các gen mã hóa các enzyme chìa khóa trong con đường sinh tổng hợp ra các chất tự nhiên mong muốn. Phương pháp này có thể giúp ta điều khiển hay định hướng cho quá trình sinh tổng hợp các chất tự nhiên ở rễ tơ để tổng hợp ra một loại hợp chất tự nhiên với hàm lượng cao. Nghiên cứu của Lodhi (1996) đã chứng minh hàm lượng
anthraquinone và alizarin trong hệ thống nuôi cấy rễ tơ của Rubia peregrina
L. tăng cao khi gắn đoạn gen mã hóa ra enzyme izochorismate synthase vào đoạn T-DNA; và theo Banerjee (2002) thì rễ tơ của A.belladonna được
chuyển gen P450 2E1 thể hiện khả năng tổng hợp chất tự nhiên với mức độ rất cao [31].
Tại Hàn Quốc, một số công ty đang sản xuất rễ tơ nhân sâm với bioreactor có dung tích 10.000 đến 20.000 lít. Sản phẩm này được làm nguyên liệu cho các dạng thực phẩm chức năng và thực phẩm khác nhau trên thị trường. Đã có rất nhiều nghiên cứu thành công trong tạo các hoạt chất từ nuôi cấy sinh khối rễ tơ [5],[6].
Với tiềm năng to lớn của hệ thống rễ tơ, các hệ thống rễ tơ của nhiều loài thực vật đã được nghiên cứu rộng rãi cho mục đích sản xuất hợp chất tự nhiên in vitro. Đặc biệt là những cây thuốc có ứng dụng lớn cho việc chữa bệnh.
Ứng dụng của rễ tơ trong phân tích chức năng của gen
Rễ tơ không chỉ được ứng dụng để sản xuất hợp chất thứ cấp mà còn được sử dụng trong các thí nghiệm nghiên cứu chức năng gen. Các đoạn gen chức năng được tái tổ hợp với gen chỉ thị gus, hoặc chỉ thị bằng huỳnh quang và được đưa vào A.rhizzogenes để chuyển vào thực vật. Thông qua quá trình biểu hiện của gen chỉ thị gus mà các gen chuyển vào rễ tơ được nghiên cứu chức năng. Một ví dụ là gen gus kết hợp với promotor alcohol dehydrogenase
(Adh) và được chuyển vào rễ tơ đậu nành. Chức năng của promotor được nghiên cứu dưới các điều kiện môi trường như: nhiệt độ thấp, thiếu khí, bị tổn thương và xử lý acid abscisic. Tất cả các chức năng đều được nghiên cứu thông qua sự biểu hiện của gen gus [47].
Biểu hiện protein ngoại lai
Rễ tơ còn được dùng để biểu hiện các protein công nghiệp và các loại protein chức năng. Nhờ vào khả năng chuyển một đoạn gen ngoại lai vào thực vật, A.rhizogenes đã được thiết kế mang các vector tái tổ hợp để có thể biểu
hiện các loại protein trong rễ tơ. Các gen ngoại lai này được gắn kết vào
genome thực vật và ổn định về mặt di truyền nên khả năng biểu hiện không bị suy giảm. Ryan (2008) đã tạo thành công dòng rễ tơ mang gen mã hóa cho
acetylcholinesterase- một protein có khả năng xử lý các hợp chất phosphat gây độc cho cơ thể. Các dòng rễ này tuy tăng trưởng chậm nhưng có hàm lượng acetylcholinesterase lên tới 3,3% hàm lượng protein tổng số [33]. Mặt khác, các nghiên cứu cho thấy có thể tạo rễ tơ mang cấu trúc kháng thể ở người hay cấu trúc vỏ protein của các virus gây bệnh nhằm bước đầu tạo nguồn vaccine thực vật. Sharp (2001) đã thành công trong việc tạo dòng rễ tơ thuốc lá mang kháng thể đơn dòng IgGI ở người[38]. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Với tiềm năng và khả năng ứng dụng to lớn của mình, hệ thống rễ tơ của nhiều loài thực vật đã được nghiên cứu rộng rãi cho mục đích sản xuất các hợp chất tự nhiên in vitro, đặc biệt là những cây thuốc có ứng dụng lớn cho việc chữa bệnh. Bên cạnh đó, rễ tơ còn là một công cụ hữu hiệu trong các nghiên cứu về gen hay công nghệ protein.