II. NỘI DUNG
3.3.1. Ảnh hưởng của nguồn mẫu đến hiệu quả chuyển gen
Loại mô thực vật là một yếu tố quan trọng trong quá trình chuyển gen. Khả năng chuyển gen phần lớn phụ thuộc vào loại mẫu biến nạp. Do đặc tính sinh lý khác nhau của mỗi loại mẫu nên khả năng nhận gen và khả năng ra rễ của từng loại mẫu khác nhau là khác nhau.
Một số nghiên cứu trước đây cho thấy rằng loại mô và tuổi của mẫu cấy có ảnh hưởng lớn đến sự cảm ứng hình thành rễ tơ. Loại mẫu và tuổi mẫu là yếu tố chính dẫn đến sự khác biệt về đặc tính sinh lý của tế bào [18].
Bảng 3.7: Ảnh hưởng của nguồn mẫu đến hiệu quả chuyển gen Nguồn mẫu Tổng số mẫu Số mẫu biểu hiện gen gus Tỷ lệ biểu hiện gus (%)
Lá mầm 74 21 28,37 ± 2,86
Thân mầm 76 3 3,89 ± 0,16
Kết quả nghiên cứu cho thấy có sự sai khác rõ rệt về khả năng nhận gen chuyển giữa mẫu thân mầm và lá mầm cây Hoàng liên gai. Khi lây nhiễm các mẫu lá mầm, thân mầm với dịch huyền phù vi khuẩn OD600 0,3 – 0,7 , thời gian lây nhiễm 10 - 30 phút, đồng nuôi cấy trong 48 giờ, có 28,37 % mẫu
lá mầm biểu hiện gen gus. Trong khi đó, mẫu thân mầm chỉ có 3,89 % mẫu
biểu hiện gen gus. Như vậy, có thể thấy trên cùng đối tượng Hoàng liên gai, từ các bộ phận khác nhau của cây mầm cũng cho hiệu quả chuyển gen là khác biệt nhau. Kết quả thể hiện ở bảng 3.7 cho thấy khi sử dụng gen chỉ thị gus
mẫu lá mầm cho hiệu quả chuyển gen cao hơn hẳn so với mẫu thân mầm. Cây mầm được sử dụng như nguồn nguyên liệu ưu tiên cho các quy trình chuyển gen nhờ Agrobacterium sp ở nhiều đối tượng bởi khả năng tiếp nhận gen và tái sinh cao. Paula và cộng sự (2007) đưa ra quy trình biểu hiện thành công gen chỉ thị gus vào thân và lá mầm cây đậu tương (Glycine max
(L.) Merill) làm tiền đề cho quá trình chuyển các gen mục tiêu vào cây đậu tương[32]. Dutt và công sự (2009) đánh giá các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả chuyển gen trên các loài khác nhau của họ cam Citrus sp qua mức độ biểu hiện của gen chỉ thị gfp. Trên nguồn vật liệu sử dụng là thân và lá mầm cây cam, hiêu quả chuyển gen dao động từ 8 dến 47 % tùy theo từng giống[19]. Phạm Bích Ngọc và đồng tác giả (2012) đã thành công trong việc tìm ra qui
trình chuyển gen tạo rễ tơ vào cây Bá Bệnh trên nguồn vật liệu thân mầm và
lá mầm thông qua chủng vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes ATCC 15834.
Nhóm tác giả đã chọn vật liệu cho quá trình biến nạp là thân và lá cây mầm. Kết quả thu được tỷ lệ cảm ứng tạo rễ tơ cao nhất là 71% và thấp nhất là 64,5% [6]. Như vậy, có thể thấy khả năng tiếp nhận gen chuyển ở cây Hoàng liên gai khá thấp. Trên nguồn vật liệu tiềm năng là cây mầm, Hoàng liên gai vẫn cho tỷ lệ biểu hiện gus khá thấp chỉ có 28,37 % mẫu lá mầm và 3,89 % mẫu thân mầm biểu hiện gus.
Hình 3.6: Ảnh hưởng của nguồn mẫu đến hiệu quả chuyển gen. a) Mẫu lá mầm Hoàng liên gai biểu hiện màu xanh chàm sau nhuộm hóa tế bào. b) Mẫu
thân mầm Hoàng liên gai có mức độ biểu hiện gen gus rất thấp.
Qua quá trình khảo sát các nguồn mẫu phù hợp, chúng tôi nhận thấy mẫu thân mầm vừa có tỷ lệ biểu hiện gus thấp 3,89 %, bên cạnh đó, các mẫu thân mầm sau khi biến nạp thường có hiện tượng mẫu bị thâm nâu và chết sau 1 tuần cấy trên môi trường diệt khuẩn. Trong khi đó các mẫu lá mầm vẫn sống sót trên môi trường diệt khuẩn, các mẫu lá mầm có màu xanh tươi sau 1 tuần chuyển gen và có đến 28,37 % mẫu lá biểu hiện gus. Do đó, chúng tôi lựa chọn lá mầm làm nguyên liệu chủ yếu cho các thí nghiệm tối ưu quy trình chuyển gen tạo rễ tơ ở cây Hoàng liên gai qua biểu hiện tạm thời gen